安徽省猪病毒性腹泻病因调查及PEDV分子流行病学研究

摘要

猪病毒性腹泻是由病毒引起的急性消化道传染病，主要病原有猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gatroenteritis coronavirus，TGEV)，猪轮状病毒(Rotavirus，RV)，猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，猪圆环病毒(Porcine circovirus virus，PCV)，猪伪狂犬病毒(Porcine pseudprabies virus，PRV)。其流行从2010年底开始在我国呈明显的上升趋势，尤其造成哺乳仔猪大量死亡，给养猪业造成了巨大的损失。其中流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)的危害最为严重，该病毒以损坏猪小肠为主，引起猪水样腹泻和严重脱水为主要临床症状，已成为降低猪出栏率的重要原因之一。本文对安徽省部分地区猪场的猪腹泻主要病毒性病原进行了流行病学调查和对 PEDV的M、N、ORF3基因的遗传进化进行了研究，研究内容如下：
　　(1)本研究对2010-2013年安徽省14个县市的23个发生猪腹泻的猪场采集了138份肛拭子、肠道及内容物，利用(RT-)PCR方法对病料中7种主要病毒性腹泻病原进行了检测：CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、RV、PRV、PCV2等7种。检测结果显示，PED阳性猪场有19个，阳性率为82.6％，PED阳性病料81份，PEDV阳性率高达58.7%。其中CSFV、PRRSV、TGEV、RV、PRV、PCV2的阳性检出率分别为2.9%、1.44%、2.17%、1.44%、4.35%、7.25%。多个猪场出现PEDV与其它病毒的混合感染，其中与PCV2的混合感染最为严重，混感率为6%。混合感染在猪腹泻病中广泛存在，圆环病毒由于其免疫抑制作用，出现更严重的临床症状。
　　(2)为了探讨安徽省流行的PEDV遗传变异情况，本研究对19个PED阳性猪场的病料进行了PEDV的遗传变异相关基因M和N及毒力基因ORF3的扩增及遗传变异分析，以弄清安徽省PEDV分子流行情况，为安徽省PED防控提供理论基础。本研究参照Genbank中PEDV序列，设计4对特异性引物对PED阳性的19个猪场的阳性病料分别进行 M、N和 ORF3基因的扩增，扩增获得的片段经切胶回收后连接pMD18-T载体，挑取阳性克隆并测序，并用DNASTAR和MEGA5.0等软件将目的基因进行同源性的比较和遗传进化分析。所扩增的目的基因片段均有完整的开放阅读框，M基因大小为681bp，N基因为1326bp，ORF3基因为675bp。M基因同源性分析表明，安徽地区 PEDV流行毒株 M基因之间同源性为98.3%-100%，与欧洲毒株(CV777；Br1/7)同源性为97.4%-98.2%，与日本毒株(83p-5)的同源性为97.4%-98.4%，与韩国毒株(DR13；CPF531；PFF1051)同源性为97.1%-98.2%，与我国其它省份：北京株(BJ2010)、广东株(GDYD)、江苏株(JS200402)、福建株(FJPT2011)、山东株(SDM)同源性为96.8%-100%，与美国毒株(USAIow164652013；USAIndiana178462013)同源性为99.1%-100%。M基因较保守，各毒株之间差异不大，为针对M蛋白的基因工程疫苗的开发奠定了基础。2012-2013年安徽地区毒株M基因与美国株同源性最高，尤其2012年的AHFY、AHLA、AHLX、2013AHFD、2013AHMAS，2013AHLX株的M基因与2013年报道的美国株(USAIndiana178462013)的同源性达到100%，表明基于M基因分析，PEDV的流行不具有地域性。基于N基因的同源性分析表明安徽地区毒株之间 N基因同源性为95.9%-99.9%，与欧洲毒株(CV777；Br1/7)的同源性为94.1%-95.9%，与日本毒株(83p-5)同源性为94.7%-97%，与韩国毒株(DR13；Chinju99)同源性为92.8%-97.1%，与美国毒株(USAIow164652013；USAIndiana178462013)同源性为97.3%-99.8%，与我国其他省份：北京株(CHBJYQ12011)、广东株(CHGDQY12011)、江苏株(JS200402)、福建株(FJPT2011)、山东株(CHSDRZ22011；YT12-4；WS12-2)、甘肃株(DZ)、广西株(CHGXNN2011)同源性为95.4%-99.5%。N基因保守程度较低，安徽地区毒株 N基因与韩国株同源性最低，与美国株同源性最高，且存在较多相同的突变位点，这为区别 PEDV基因型提供了依据。基于 ORF3基因的同源性分析表明安徽地区毒株之间的同源性为96.7%-100%，与欧洲株(CV777；Br1/7)同源性为94.9%-97%，与韩国株(DR13；Chinju99；VF131；PFF188)同源性分别为96.3%-98.7%，与美国株同源性为96.3%-99.6%，与中国其它省份：江苏株(JSSX2011；JSTS2012；JSYC2012)，上海株(ZJC24)，河南株(CH/TY/12)，福建株(FJ)的同源性分别为95.9%-100%。安徽PEDV ORF3基因与欧洲疫苗株同源性最低，安徽地区毒株与疫苗株差异较大，这可能是目前 PEDV在免疫猪场暴发的原因之一。2012年安徽地区毒株基于ORF3基因可分为3个群，群成员ORF3基因之间的同源性为100%。2013年安徽地区毒株之间ORF3基因同源性普遍下降，ORF3基因序列完全相同的毒株明显减少。对3段基因遗传进化分析表明：安徽地区毒株与早期分离的欧洲株亲缘关系最远，提示PEDV在流行过程中发生了变异。同时，与2011年之前公布的日本、韩国的毒株亲缘关系也较远，表明PEDV在流行过程中可能出现了新的基因型。

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文献综述

1 引言

2材料和方法

2.1实验材料

2.1.1 病料来源

2.1.2 菌株及质粒

2.1.3 主要的试剂及试剂盒

2.1.4 主要试验仪器

2.1.5 主要培养基

2.1.6 主要缓冲液

2.2方法

2.2.1 猪腹泻病毒的临床诊断鉴定

2.2.2 猪腹泻病毒的实验室诊断鉴定

2.2.3 PEDV基因的克隆及测序

3 结 果

3.1 腹泻病猪的临床诊断结果

3.2 病毒性腹泻病原的实验室检测结果

3.2.1 PCR检测结果

3.3 PEDV M、N、ORF3基因的扩增和测序

3.3.1 M、N、ORF3基因的扩增

3.3.2 M、N、ORF3基因序列分析结果

3.3.3 M、N、ORF3基因遗传进化分析结果

4 讨 论

4.1 PEDV在安徽省的流行情况

4.2安徽省PEDV M基因分析

4.3安徽省PEDV N基因分析

4.4安徽省PEDV ORF3基因分析

结论

参考文献

致谢

个 人 简 历

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