中药提取物对奶牛乳腺上皮细胞增殖及蛋白含量的影响

摘要

本研究通过培养奶牛乳腺上皮细胞，并以该细胞为研究对象，研究中药复方透皮贴剂和中药复方灌注液对奶牛乳腺上皮细胞增殖、总蛋白含量以及β-酪蛋白含量的影响。从奶牛乳房无菌采取乳腺组织，通过体外原代培养、分离纯化以及传代等方法建立稳定的奶牛乳腺上皮细胞系。倒置显微镜下对奶牛乳腺上皮细胞进行观察，做形态学鉴定；绘制细胞生长曲线；通过SDS-PAGE电泳鉴定奶牛乳腺上皮细胞所分泌的β-酪蛋白。制备中药复方透皮贴剂及其主要成分的单味中药提取物和中药复方灌注液及其主要成分的单味中药提取物，添加到奶牛乳腺上皮细胞培养液中，研究其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、总蛋白以及β-酪蛋白含量的影响。
　　试验结果如下：
　　本试验中，通过组织块培养法可获得奶牛乳腺细胞，通过胰蛋白酶多次消化的方法可基本去除奶牛乳腺细胞中的成纤维细胞，获得较为纯化的奶牛乳腺上皮细胞；经过传代以后，奶牛乳腺上皮细胞的形态以及生理功能不发生改变，从而建立了稳定的奶牛乳腺上皮细胞系。
　　采用不同浓度的中药复方灌注液及其单味中药的提取液处理奶牛乳腺上皮细胞1d后，在浓度为10 mg?mL-1时OD值最大，但促进细胞增殖的效果不显著（P>0.05）。采用10 mg?mL-1的中药提取物处理乳腺上皮细胞6 d，与对照组相比，紫花地丁和黄芪对乳腺上皮细胞增殖作用不明显（P>0.05）；泽兰和鸡血藤在第3 d时即能极显著促进细胞增殖（P<0.01)，而中药灌注液在第5 d时能极显著促进细胞增殖（P<0.01)。
　　采用不同浓度的中药复方灌注液及其单味中药的提取液处理奶牛乳腺上皮细胞1 d后，在浓度为15 mg?mL-1时细胞总蛋白含量最大。15 mg?mL-1的中药提取物处理乳腺上皮细胞6 d，与对照组相比，紫花地丁提取物对细胞总蛋白含量无显著影响（P>0.05）；泽兰、鸡血藤提取物和复方灌注液在第1 d时对细胞总蛋白含量有显著影响，且随时间延长总蛋白含量增加，差异极显著（P<0.01）；诃子提取物在第1 d时极显著促进细胞分泌总蛋白（P<0.01），第3 d与第1 d总蛋白含量相比，极显著下降（P<0.01），第5 d同第3 d相比，细胞总蛋白含量极显著增加（P<0.01）。
　　采用不同浓度的中药复方灌注液及其单味中药的提取液处理奶牛乳腺上皮细胞1 d后，在浓度为10 mg?mL-1时β-酪蛋白含量最大。10 mg?mL-1的中药提取物处理奶牛乳腺上皮细胞6 d，与对照组相比，在第1 d时，紫花地丁、黄芪、泽兰、诃子以及复方灌注液组能够极显著促进细胞β-酪蛋白的分泌（P<0.01），鸡血藤能够显著促进β-酪蛋白的分泌（0.010.05）；第5 d与第3 d相比，灌注液组差异极显著（P<0.01），黄芪、泽兰、诃子组差异显著（0.010.05）。
　　采用不同浓度的中药复方透皮贴剂及其单味中药的提取液处理奶牛乳腺上皮细胞1 d后，在浓度为10 mg?mL-1时OD值最大，但促进细胞增殖的效果不显著（P>0.05）。10 mg?mL-1的中药提取物处理乳腺上皮细胞6 d，与对照组相比，重楼组在第5 d能够显著促进细胞增殖（0.010.05）。
　　采用不同浓度的中药复方透皮贴剂及其单味中药的提取液处理奶牛乳腺上皮细胞1 d后，在浓度为10 mg?mL-1时总蛋白含量最大。10 mg?mL-1的中药提取物处理奶牛乳腺上皮细胞6 d，与对照组相比，重楼组在第5 d能够极显著促进细胞β-酪蛋白分泌（P<0.01），黄连组、马兰组、透皮贴剂组在第1 d时就能够极显著提高细胞β-酪蛋白含量（P<0.01），木芙蓉组在第3 d能够极显著提高细胞β-酪蛋白含量（P<0.01）。
　　采用不同浓度的中药复方透皮贴剂及其单味中药的提取液处理奶牛乳腺上皮细胞1 d后，在浓度为10 mg?mL-1时β-酪蛋白含量最大，但促进作用不显著（P>0.05）。10 mg?mL-1的中药提取物处理乳腺上皮细胞6 d，与对照组相比，在第1d时，重楼组、木芙蓉组和透皮贴剂组β-酪蛋白含量有所增加，但差异不显著（P>0.05）。第3 d和第1 d相比，β-酪蛋白含量增加，差异极显著（P<0.01）；第5 d和第3 d相比，β-酪蛋白含量增加，差异极显著（P<0.01）。黄连组、马兰组β-酪蛋白含量变化不明显（P>0.05）。
　　试验证实，采用适宜浓度的中药提取物处理奶牛乳腺上皮细胞，可以显著促进细胞增殖和总蛋白以及β-酪蛋白的分泌，表明中药复方灌注液以及透皮贴剂可以通过修复损伤乳腺细胞从而改善奶牛乳房炎的症状。

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文献综述

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物和中药

1.1.2 试剂与配制方法

1.1.3 器材

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的培养

1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞生物学性状的检测

1.2.3 中药提取液的制备

1.2.4 中药提取液对奶牛乳腺上皮细胞的影响

1.3统计学处理

2 结果与分析

2.1 奶牛乳腺上皮细胞形态观察

2.2 奶牛乳腺上皮细胞生物学性状的检测

2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞生长曲线

2.2.2 乳腺上皮细胞瑞氏-吉姆萨染色

2.2.3β-酪蛋白（β-CN）电泳

2.3 中药复方灌注液及其主要成分对乳腺上皮细胞的影响

2.3.1 中药复方灌注液及其主要成分对细胞增殖的影响

2.3.2 中药复方灌注液对细胞总蛋白含量的影响

2.3.3 中药复方灌注液对细胞β-酪蛋白含量的影响

2.4 中药复方透皮贴剂对奶牛上皮细胞的影响

2.4.1 中药复方透皮贴剂对细胞增殖的影响

2.4.2 中药复方透皮贴剂对细胞总蛋白含量的影响

2.4.3 中药复方透皮贴剂细胞β-酪蛋白含量的影响

3 讨论

3.1奶牛乳腺上皮细胞的体外培养

3.1.1 奶牛乳腺的发育

3.1.2 奶牛乳腺上皮细胞的增殖

3.1.3 奶牛乳腺上皮细胞分泌的β-酪蛋白

3.1.4 奶牛乳腺干细胞

3.2 中药提取物对奶牛乳腺上皮细胞的作用

3.2.1 中药复方灌注液对奶牛乳腺上皮细胞的作用

3.2.2 中药复方透皮贴剂对奶牛乳腺上皮细胞的作用

4 结论

参考文献

致谢

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