刺槐种子提取物杀蚜活性及其应用研究

摘要

化学农药的大量施用，造成环境污染，食品安全等问题，研发植物源杀虫剂是解决上述问题的重要途径之一。本研究以棉蚜（ Aphis gossypii Glover）及甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hiibner）为供试害虫，采用点滴法，评价了13种植物提取物的杀虫生物活性，筛选出对棉蚜具有很好活性的刺槐(Robinia pseudoacacia L)种子乙醇提取物和三种香樟（Cinnamomum camphora L. Presl）精油（香樟叶片、枝条和种子精油）。然后以棉蚜为供试害虫，以三种香樟精油为研究材料，开展了精油化学成分分析；全面评价了精油的杀蚜和驱蚜活性，明确了精油中的一种主要活性化合物。以刺槐种子为研究植物材料，采用活性追踪方法，分离并鉴定出刺槐种子中二个主要的杀蚜活性化合物；测定了处理后棉蚜体内三种代谢酶活性的变化，探讨活性化合物对棉蚜的作用机理；以刺槐种子乙醇提取物为活性成分，研制了一种水乳剂制剂（water emulsion，EW），考察了其田间药效。本研究旨在开发新型植物源杀蚜剂，为高效利用刺槐作为植物源杀虫资源提供参考。主要研究结果如下：
　　1、13种植物提取物杀虫活性的筛选
　　以豚草（Ambrosia artemisiifolia L.）全株、白屈菜（Chelidonium majus）全株、飞燕草（Consolida ajacis.L）全株、海芒果（Cerbera manghas）叶片、夹竹桃（Nerium indicum）叶片、苦豆子（Sophora alopecuroides.L）种子、苦楝果（Melia azedarach）种子、刺槐(Robinia pseudoacacia L)种子及钩吻（Gelsemium elegans）块茎为研究植物材料，以乙醇-水系统作为提取溶剂进行浸提，以紫藤（Wisteria floribunda(Willd.) DC）叶、香樟（Cinnamomum camphora(L.) Presl）叶片、香樟（Cinnamomum camphora(L.) Presl）枝条和香樟（Cinnamomum camphora L. Presl）种子为植物材料提取植物精油。以棉蚜和甜菜夜蛾为供试害虫，采用室内触杀活性研究的点滴方法，对供试的13种植物提取物进行室内杀虫活性筛选。
　　结果表明：在5000 mg/L剂量下，供试的13种植物提取物，对甜菜夜蛾的72 h校正死亡率在3.33％-63.33%之间，其中刺槐乙醇提取物表现出对甜菜夜蛾具有较好触杀活性，72 h校正死亡率为60.00%；三种香樟精油也具有一定的触杀生物活性，72 h校正死亡率均在50.00%以上。在500 mg/L的供试剂量下，13种植物提取物对棉蚜的24 h校正死亡率在31.46%-86.52%之间；其中刺槐种子乙醇提取物24 h校正死亡率最高为86.52%，对棉蚜的致死中浓度（LC50）为148.596 mg/L（24 h）。精油中三种香樟精油活性最高，24 h校正死亡率均在65%以上，香樟叶片、枝条和种子精油对棉蚜的LC50分别为312.42 mg/L，376.77 mg/L和200.96 mg/L（24 h）。
　　2、香樟精油化学成分分析及杀虫活性评价
　　采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用系统(GC×GC-TOFMS)分析了香樟叶片、香樟枝条和香樟种子精油的化学成分组成，并采用主成分分析比较了三种香樟精油的化学成分及含量差异。全面评价了3种香樟精油及其主要成分芳樟醇对蚜虫的触杀生物活性和趋避生物活性，明确了芳樟醇是香樟精油对蚜虫具有生物活性的的主要活性化合物。香樟叶片、枝条和种子精油对蚜虫呈现出较高的生物活性，其中香樟种子精油生物活性最高，香樟叶片、枝条和种子精油对蚜虫48 h的触杀生物活性的LC50分别为245.79 mg/L，274.99 mg/L和146.78 mg/L；在供试浓度为20μL/mL对蚜虫的趋避率分别高达83.83%，72.13%和89.86%（24 h）。芳樟醇对蚜虫具有较高的生物活性，对蚜虫48 h的触杀生物活性的LC50为262.77 mg/L,；在供试浓度为10μL/mL对蚜虫的24 h趋避率就可高达76.56%。
　　3、刺槐种子提取物杀虫成分的分离与鉴定
　　以棉蚜（Aphis gossypii Glover）作为试虫，采用活性追踪方法，测定了刺槐种子提取物各流分的触杀生物活性，结果表明，以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取的各相中，在500 mg/L剂量下，石油醚萃取物对棉蚜表现出了最好的触杀活性，24 h校正死亡率为94.29%，LC50为70.442 mg/L（24 h）。
　　石油醚萃取物进一步采用多次硅胶柱分离，共获得9个馏分，即F1-F9，其中3个高活性馏分为F7、F8和F9，在250mg/L供试浓度下，对棉蚜的24 h校正死亡率分别为97.73%、88.66%和87.53%。对高活性馏分F7进行硅胶柱层析分离，获得S1-S6六个次级馏分，在250mg/L供试浓度下，2个高活性次级馏分S1和S5对棉蚜的24 h校正死亡率分别高达88.74%和96.83%。S5经反复凝胶柱分离，最终分离获得活性物质（Compound1，简称C1），C1对棉蚜24 h触杀活性的LC50为65.649 mg/L并在C1中鉴定了二个活性化合物。
　　通过气相色谱超高分辨四极杆静电场轨道阱质谱（ Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS简称：QE-GC）对活性物质 C1进行分析和鉴定，通过高分辨的 EI-MS图谱和分子离子峰碎片等数据信息进行综合分析，最终确定了二个活性化合物，其结构分别为2,4-二叔丁基苯酚，分子量为206，化学式为 C14H22O；和 trans,trans-9,12-十八碳二烯酸甲酯，分子量为294，化学式为C19H34O2。
　　4、活性物质对棉蚜体内3种代谢酶的活性影响
　　用活性物质对棉蚜进行点滴触杀处理，测定其对棉蚜蚜体内3种重要酶系：乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（CarE）活性变化与活性化合物处理的剂量及处理时间之间关系。
　　结果表明：处理后试虫体内乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S转移酶（GSTs）及羧酸酯酶（CarE）的酶活性整体上均被抑制，并显示出明显时间—效应关系，随着时间变化酶活力虽有波动，但均显著低于对照。同时AChE和GSTs表现出很明显的剂量效应关系，而CarE酶活力表现出低剂量促进，高剂量抑制的作用，而且随着活性物质处理浓度的逐渐增加，抑制作用逐渐的增强，CarE酶活力逐渐降低。结果说明活性物质对棉蚜的触杀作用可能与这些酶的活性被抑制有关。
　　5、刺槐种子乙醇提取物水乳剂的研制
　　以刺槐种子乙醇提取物为有效成分，通过对溶剂、乳化剂、消泡剂等表面活性剂的筛选与最佳配比组合的优化，研制出了10%刺槐种子乙醇提取物水乳剂（EW）。该水乳剂（EW）的配方为：刺槐种子乙醇提取物质量百分比为10%，溶剂为18%，乳化剂为12%，抗冻剂为3%，消泡剂为1%，其他助剂1%，加水补足至100%。通过对该制剂外观稳定性、低温稳定性、分散稳定性、稀释稳定性和倾倒性的测定，该制剂符合EW制剂标准质量。
　　6、刺槐种子乙醇提取物水乳剂的田间药效试验
　　以田间蚜虫为防治对象，以田间药效试验方法为指导，开展了10%的刺槐种子提取物水乳剂、竹醋液及10%的刺槐种子提取物水乳剂与竹醋液混配液剂的田间防效实验，结果表明：10%的刺槐种子提取物水乳剂在200、400、600 mL/亩的三种施用剂量下，药后3天对蚜虫的防效均大于70%以上，药后7天均高达95%以上，优于植物源对照药剂藜芦碱可溶性液剂推荐剂量的防效88.94%。混配药剂的防效表现的更好，在施药3天后，低剂量的混配剂的防效均在80%以上，与高剂量单剂的防效相当。结果说明：刺槐种子水乳剂能够作为植物源杀蚜剂使用；混配药剂中，竹醋液能够对供试药剂起到增效作用，并且达到了减少农药使用量且增效的效果。
　　综上所述，通过对潜在活性植物杀虫活性的筛选，筛选出了香樟精油和刺槐种子具有很好的杀蚜活性。通过对香樟精油杀蚜和驱蚜生物活性评价，表明芳樟醇是香樟精油中主要的杀蚜活性物质，芳樟醇和香樟精油（尤其种子精油）均具有开发成天然植物源杀蚜剂和驱蚜剂的潜力；通过对刺槐杀蚜活性的追踪分离，最终获得了二个主要的杀蚜活性化合物；并对刺槐种子提取物开展了制剂及应用技术研究。本研究对于高附加值利用香樟植物资源和刺槐植物资源，以及新型植物源杀蚜剂的开发利用提供理论基础和技术支撑。

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第一章 文献综述

1.1 化学农药的作用与问题

1.2 植物源农药研究现状

1.3 植物源杀虫剂研究进展

1.4 刺槐化学成分和生物活性研究概况

1.5 香樟精油化学成分和生物活性研究概况

1.6 蚜虫的危害性

1.7 植物源杀蚜剂存在的科学问题

1.8 论文选题依据及研究目的

1.9 主要研究内容及技术路线

第二章 13种植物提取物杀虫活性筛选

2.1 材料与方法

2.2 数据处理

2.3 结果与分析

2.4 小结与讨论

第三章 香樟精油化学成分分析及其杀蚜活性研究

3.1 材料与方法

3.2 数据处理

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第四章 刺槐种子提取物杀蚜活性成分追踪

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 小结与讨论

第五章 刺槐种子活性化合物对棉蚜体内酶活性影响的研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 小结与讨论

第六章 刺槐种子提取物制剂的研制及应用技术研究

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 小结与讨论

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 讨论与展望

参考文献

致谢

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