枯草芽孢杆菌菌株RSS-1对油菜菌核病菌的生防作用及其机制研究

摘要

由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）引起的油菜菌核病是油菜生产上的一种重要病害。在我国，油菜菌核病发生普遍且危害严重，导致油菜产量和品质的严重下降。生产上针对油菜菌核病的防治措施主要为化学药剂防治和轮作相结合的综合防治措施，然而连年大量使用化学药剂不仅造成了自然环境的严重污染，而且已经导致了油菜菌核病菌抗药性的产生。在目前尚未发现对油菜菌核病具有免疫或高抗的油菜品种的条件下，寻找高效且对环境友好的方法对油菜菌核病进行防治已迫在眉睫。植物拮抗细菌作为新发掘的微生物资源，已经被广泛开发且应用于生产实践。本学位论文在对油菜菌核病菌生防细菌的分离、鉴定的基础上，研究了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株RSS-1对油菜菌核病菌的防治作用及生防机理；进一步对枯草芽孢杆菌菌株RSS-1产生抗菌物质的条件进行了优化以及对抗菌物质进行了纯化；同时对枯草芽孢杆菌菌株RSS-1在油菜根系的定殖及对土壤微生物群落的影响、枯草芽孢杆菌菌株RSS-1的抑菌谱进行了系统研究。主要研究结果如下：
　　1油菜菌核病菌生防细菌的筛选及防效研究
　　从安徽省合肥市的油菜根际土壤中共分离到211株细菌菌株，其中对油菜菌核病菌具有生防作用的菌株有8株：RSS-1、RSS-10、RSS-14、RSS-32、RSS-40、RSS-43、RSS-46和RSS-55。平板对峙培养实验结果表明，生防菌株RSS-1、RSS-10、RSS-14、RSS-32、RSS-40、RSS-43、RSS-46和RSS-55对油菜菌核病菌的抑制率分别达到93.33％、77.33%、70.67%、45.33%、56.67%、42.67%、15.33%和53.33%，其中以RSS-1的抑制效果最好，抑菌效果高达93.33%。无论是RSS-1的菌悬液还是无菌培养滤液几乎完全抑制了菌核的产生。盆栽实验结果表明，生防菌株RSS-1的1×106、1×107、1×108 cfu/mL浓度的菌悬液以及无菌培养滤液均能有效抑制油菜菌核病的发展，其病情指数分别为17.9、18.2、9.5和11.0，而对照组的病情指数则高达91.0。无论是在接种核盘菌前24h还是接种核盘菌后24h，生防菌株RSS-1的1×108 cfu/mL浓度的菌悬液亦能有效抑制油菜菌核病的发展，其病情指数分别为23.8和30.0。
　　2生防细菌菌株RSS-1的鉴定
　　从安徽省合肥市的油菜根际土壤中分离得到的生防细菌菌株 RSS-1的菌体细胞呈杆状，芽孢内生，单细胞菌落呈圆形，乳白色，表面干燥有皱褶，无光泽，不光滑，菌落边缘不规则呈锯齿状。该生防细菌为革兰氏阳性、好氧菌；能够耐受10%的氯化钠；接触酶和 V-P反应呈阳性；能够还原硝酸盐、水解淀粉和明胶，但是不能水解酪氨酸；能够产生H2S，并能将糖醇发酵产生酸，但不产生吲哚。供试菌株RSS-1的16S rDNA的碱基序列（GenBank登录号为KR086418）与3条枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的16S rDNA的碱基序列（GenBank登录号分别为EU723210、KC460988和KF636527）完全相同，而与另一条枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的16S rDNA的碱基序列（GenBank登录号为GU258545）仅有一个碱基的不同，其同源性高达99.8%以上。根据菌体形态、培养特征、生理生化特性以及16S rDNA的序列分析结果，生防细菌菌株RSS-1被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
　　3枯草芽孢杆菌菌株RSS-1的生防机理研究
　　枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株RSS-1对油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）的菌丝具有明显的抑制作用，受抑制的菌丝细胞壁增厚、皱缩、畸形，并有明显的原生质外渗现象；菌株RSS-1亦能显著抑制核盘菌侵染油菜叶片，经菌株RSS-1的菌悬液处理后在油菜叶片的下表皮内仅能观测到少许菌丝，甚至无菌丝侵入油菜叶片，而未经菌株RSS-1的菌悬液处理的油菜叶片下表皮内则可观察到大量菌丝。枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株RSS-1可显著诱导油菜体内多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）酶活性的提高，经菌株RSS-1的菌悬液处理后，PPO和SOD的酶活性分别于处理后第5 d和4 d达到最大，而POD的酶活性则从处理后第4 d迅速增加。枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株RSS-1亦可显著抑制纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）的酶活性，经菌株 RSS-1的菌悬液处理后，纤维素酶、PG和 PMG的酶活性与未处理组的酶活性存在显著差异（P<0.01）。枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株RSS-1的菌悬液可显著抑制油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）在侵染油菜的过程中草酸的产生。在油菜叶片接种油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）后草酸的产生量在持续增加，从接种后12 h的9.38 mg/g增加到接种后96 h的12.03 mg/g。经生防菌株 RSS-1的菌悬液处理后油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）产生草酸的量虽然有所增加，但是，增加的速率比较缓慢，从接种后12h的8.41 mg/g到接种后96h仅增加到9.43 mg/g。方差分析结果表明，在油菜菌核病菌（S. sclerotiorum）侵染油菜的过程中经生防菌株RSS-1的菌悬液处理组的产生草酸的量显著（P<0.05）低于未处理组的产生草酸的量。
　　4菌株RSS-1在油菜周际的定殖及对油菜周际微生物群落的影响
　　通过抗利福平和硫酸链霉素双抗药性标记研究了枯草芽孢杆菌菌株 RSS-1在油菜周际的定殖，实验结果表明，喷雾处理后双抗药性标记菌株RSS-1R可在油菜周际定殖，处理后2 d，从油菜叶片和茎杆上回收到的双抗药性标记菌株RSS-1R的平均菌量为3.67×105 cfu/g鲜组织，此后油菜叶片和茎杆上的双抗药性标记菌株 RSS-1R的种群数量显著下降（P<0.05），到处理后6 d，从油菜叶片和茎杆上回收到的双抗药性标记菌株RSS-1R的平均菌量下降为1.00×103 cfu/g鲜组织，到处理后10 d，从油菜叶片和茎杆上就回收不到双抗药性标记菌株RSS-1R。喷雾处理后4d，可从油菜根际土壤中回收到双抗药性标记菌株RSS-1R，其回收到的平均菌量为6.67×103 cfu/g湿土，到处理后10 d，油菜根际土壤中的双抗药性标记菌株RSS-1R的种群数量显著下降（P<0.05），但至处理后30d，仍可从油菜根际土壤中回收到双抗药性标记菌株RSS-1R。灌根处理后2d，可从油菜根际土壤中回收到双抗药性标记菌株RSS-1R，到处理后4d，从油菜根际土壤中回收到的双抗药性标记菌株RSS-1R的平均菌量增加到6.31×105 cfu/g湿土，但从处理后4 d至30 d，油菜根际土壤中的双抗药性标记菌株RSS-1R的种群数量无显著差异（P<0.05）。同时研究了通过喷雾和灌根处理后枯草芽孢杆菌菌株RSS-1对油菜周际其他微生物群落的影响，结果表明，喷雾处理后，短期内油菜植株上或根际土壤中的细菌种群数量均显著增加（P>0.95）；喷雾处理后10 d内，双抗药性标记菌株 RSS-1R对油菜根际土壤中的细菌种群数量的影响不显著（ P<0.05），但是喷雾处理后20 d，油菜根际土壤中的细菌种群菌量显著增加（P>0.95）。灌根处理后，油菜根际土壤中的细菌种群数量显著增加（P>0.95），到处理后20 d，油菜根际土壤中的细菌种群数量显著下降（P<0.05），到处理后30 d，油菜根际土壤中的平均细菌菌量再恢复到初始水平。无论是喷雾还是灌根处理后，油菜周际的真菌和放线菌的种群数量变化均不显著（P<0.05）。
　　5枯草芽孢杆菌菌株RSS-1产生抗菌物质条件的优化
　　在摇瓶条件下优化了枯草芽孢杆菌菌株RSS-1产生抗菌物质的条件，单因素和正交实验结果表明，菌株RSS-1产生抗菌物质的最佳培养基组分比例是：碳源为2.0%的玉米淀粉，氮源为1.5%的蛋白胨，无机盐为0.05%的 MgSO4；当培养基初始 pH为6.0，接种量为0.1%，在28°C、180 rpm的摇床上连续培养5 d后获得的枯草芽孢杆菌菌株RSS-1的无菌培养滤液的抑菌活性最强。
　　6枯草芽孢杆菌菌株RSS-1的抑菌谱研究
　　采用平板对峙法测定了枯草芽孢杆菌菌株RSS-1对17个属41株植物病原真菌菌丝生长的影响，结果表明，菌株RSS-1对41株植物病原真菌均有抑制作用。尤其对灰葡萄孢属真菌的抑菌效果最好，其抑菌率达到90%以上；其次为单端孢属和炭疽菌属真菌，其抑菌率亦达到80%以上，而对镰孢属、赤霉属和腐霉属真菌的抑菌效果较差，其抑菌率只有28～48%。方差分析结果表明，枯草芽孢杆菌菌株 RSS-1对不同属的植物病原真菌的抑制作用存在显著差异（P<0.01），甚至对同一属的不同菌株间的抑制作用亦存在显著差异（P<0.01）。
　　7菌株RSS-1抗菌活性蛋白的初步纯化及理化性质研究
　　通过硫酸铵沉淀法对枯草芽孢杆菌菌株 RSS-1产生的抗菌活性蛋白进行了初步纯化，明确了菌株 RSS-1产生的抗菌活性蛋白沉淀的最佳硫酸铵饱和度为20%。同时研究了温度、pH、蛋白酶和紫外线照射时间对枯草芽孢杆菌菌株 RSS-1产生的抗菌活性蛋白稳定性的影响。实验结果表明，该抗菌活性蛋白比较耐高温，抗菌活性蛋白经100°C处理60 min后任可保持原有抑菌活性的71.3%；在pH为3~10范围内均有抑菌活性，且在pH为5~8范围内其抑菌活性无显著变化；该抗菌活性蛋白对紫外线照射和3种蛋白酶不敏感，当紫外线照射时间达到180 min时，其抗菌活性蛋白的抑菌活性仍可保持原有抑菌活性的88.3%。

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缩略词

第一章 文献综述

1 油菜菌核病菌的研究进展

2 油菜菌核病菌的菌核形成及其相关影响因子

3 油菜菌核病菌与寄主的互作

4 植物病害的生物防治

5 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的作用

6 本研究的目的与意义

第二章 油菜菌核病菌生防细菌的筛选及防效研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 生防细菌菌株RSS-1的鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 枯草芽孢杆菌菌株RSS-1的生防机理研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 RSS-1在油菜周际的定殖及对其他微生物群落的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 枯草芽孢杆菌菌株RSS-1产生抗菌物质条件的优化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七章 枯草芽孢杆菌菌株RSS-1的抑菌谱研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第八章 菌株RSS-1抗菌活性蛋白的初步纯化及理化性质研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

全 文 总 结

一、本文结论

二、本文的主要创新点

三、今后研究设想

参考文献

附录

致谢

作者简介