对二化螟高毒力真菌的生物学及固相培养技术研究

摘要

二化螟Chilo suppressalis是亚洲地区最重要的水稻害虫之一，对我国水稻高产、稳产造成严重的影响。近年来二化螟的大面积发生以及对水稻等作物的为害日驱严重，因其具有钻蛀性危害的特点，对其防治一直相对比较困难。因此，开展对二化螟的致病机理研究、新型微生物农药制剂的研究，对有效的防控二化螟具有非常重要的意义。本文通过病原真菌的筛选、病原真菌对二化螟的毒力测定，以及病原真菌的分子鉴定，筛选出了对二化螟具有高毒力的球孢白僵菌，系统评价了白僵菌对二化螟的应用效果，为二化螟的生物防治及白僵菌的应用提供了理论依据。实验获得的主要结果如下：
　　1.病原真菌的分离纯化及生物学特性研究
　　采集田间自然罹病的二化螟僵虫500头，利用组织分离法，从二化螟僵虫虫体上分离出杀虫真菌36株，经真菌培养纯化后，保存备用。
　　从分离纯化的36株杀虫真菌中筛选出10株对害虫有致病力的真菌，测定菌落生长直径、初始产孢时间、产孢量以及孢子萌发率等多项生物指标。结果显示：菌株Bbr14、Bbr84、YQ147和菌株QING在SDAY培养基上培养7d后，其菌落直径均超过1.4cm，最高的达到1.89cm，表现出良好的生长性状。菌株Bbr84、QING、YQ147和Bbr14等4株菌株初始产孢时间分别是2.83d、3.03d、3.22d和3.49d，与其他6株菌株相比时间较短；产孢量分别是3.28×108孢子/cm2、3.12×108孢子/cm2、3.01×108孢子/cm2、2.85×108孢子/cm2，产孢量相对较高；该4株菌株的萌发率相对较高，分别为96.14％、95.24%、92.12%和90.11%，均超过90%。
　　2.病原真菌对二化螟的毒力测定
　　以水稻害虫二化螟为研究对象，利用喷雾法测定所筛选的10株菌株在相同浓度、湿度和温度下对二化螟不同虫态的室内毒力。结果表明：不同菌株对不同虫态二化螟的毒力效果差异显著。真菌YQ147、QING、Bbr14、Bbr84在浓度为1.0×108孢子/mL下均对二化螟具有较强的致病力，其中真菌YQ147在处理后第10d对二化螟3龄幼虫的累计校正死亡率达到78.4%，LT50为5.8d，对二化螟卵块的累计校正死亡率达到99.7%，LT50为3.54d，实验结果明显高于其他菌株。对二化螟的室内毒力测定显示，二化螟的累计校正死亡率越高，LT50越小，菌株的致病效果就越好。
　　3.高毒力菌株入侵机理和分子鉴定
　　通过室内毒力测定，筛选出毒力最强的菌株，通过扫描电镜观察杀虫真菌分生孢子对二化螟的侵染过程，研究其入侵机理；根据该菌株的生物学特性，利用白僵菌Beauveria sp.18S rDNA ITS序列进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和序列分析，并在核酸序列数据库中进行同源性序列对比，以及构建系统树确定其所在分支，最终确定其种类。结果显示该菌为白僵菌属球孢白僵菌Beauveria bassiana。
　　4.响应面法优化高毒力病原菌株的营养条件
　　选择价廉易得的实验材料作为固体发酵培养基，以单因素的实验为基础，利用响应面组合设计实验条件参数，对球孢白僵菌固体发酵培养基配方比例进行优化，以发酵7d的产孢数量为发酵配方的质量标准。优化实验结果表明：固体培养基中米粉、花生壳和稻壳的配比为5.00g：1.00g：0.65g时，测得单位重量培养基中菌株YQ147的产孢量最高，达到4.0723×1010孢子/g，比单因素实验的最高值3.858×1010孢子/g高出5.49%，与理论预测值基本相一致。

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1 文献综述

1.1 二化螟概述

1.2 病原真菌在防治害虫中应用

1.3 病原真菌的应用推广

2 引言

2.1 研究背景与意义

2.2 研究内容

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 试验方法

4 结果与分析

4.1 10株病原真菌的生物学特征

4.2病原真菌对二化螟的室内毒力

4. 3 病原真菌侵染后二化螟症状

4. 4 病原真菌对幼虫体表的侵染过程

4.5 高毒力菌株的分子鉴定

4.6高毒力菌株的发酵与响应面优化实验分析

5讨论

5.1 白僵菌生物学性状研究

5.2 高毒力菌株筛选指标

5.3 真菌的分子鉴定

5.4 真菌的固态培养条件参数优化

6 结论

6.1 菌株的生物学特征

6.2真菌对二化螟幼虫的毒力

6.3 真菌对二化螟的侵染机理

6.4 高毒力菌株的分子鉴定

6.5 真菌发酵与响应面优化实验结果

参考文献

致谢

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