分子伴侣和融合标签改善TEV蛋白酶折叠的效应

摘要

同义突变所引起的蛋白质折叠受损正逐渐成为人们研究的热点，人类部分基因因同义突变而罹患疾病，因此改善同义突变带来的折叠损伤至关重要。在大肠杆菌中通过同义突变提高异源蛋白表达水平的同时，也会降低特定蛋白的折叠，如烟草蚀斑病毒蛋白酶( Tobacco etch virus protease，TEVp)。有关改善密码子突变体蛋白折叠的研究未见报道。为此，我们以大肠杆菌表达系统为模型，研究共表达分子伴侣或者融合标签对不同TEVp突变体蛋白折叠的影响，获得以下结果：
　　1.定性和定量分析了共表达分子伴侣组A（ GroEL、GroES和GrpE）或组B（ DnaK、DnaJ和ClpB）对6种TEVp突变体（4种氨基酸突变体，2种同义突变体）表达水平的影响。16℃诱导24 h后，共表达分子伴侣组B改善TEVp突变体表达水平要高于分子伴侣组A，表明低温条件下不同分子伴侣在改善同义突变体蛋白折叠时的水平存在差异。
　　2.定性和定量分析了热激条件下，分子伴侣对靶蛋白的折叠效应，37℃诱导4 h后，共表达分子伴侣组 A改善对 TEVp突变体表达水平要高于分子伴侣组 B，表明在高温胁迫下只有特定的分子伴侣组对改善同义突变体蛋白折叠有作用。
　　3.分析了两种标签及TEVp识别序列对6种TEVp突变体的的表达水平影响：重组表达的细胞的粗酶液上清液中，SDS-PAGE检测到了明显 MBP融合的 TEVp氨基酸突变体特异条带；而含有TEVp识别序列的融合蛋白由胞内自剪切产生的无标签TEVp突变体条带不明显；Trx标签对TEVp的表达水平没有明显改善作用。
　　4.分析了两种标签和TEVp识别序列对6种TEVp突变体酶学活性影响。和前期研究结果相比，MBP提高TEVp氨基酸突变体的水溶性和活性，但是对同义突变体的活性没有明显作用，插入的识别序列近一步提高TEVp氨基酸突变体活性，但是对同义突变体没有明显作用。Trx标签对 TEVp氨基酸突变体的水溶性没有较大改善但可提高其活性，但对同义突变体活性没有提升，插入的TEVp识别序列也没有明显提升两类突变体活性的作用。
　　5.分析了提高胞内稀有tRNA水平对融合的TEVp突变体表达和酶学活性的影响。在RosettaTM（DE3）中，融合MBP和Trx标签的TEVp氨基酸突变的活性要比在BL21（DE3）中表达时高，Trx标签对氨基酸突变体的活性提升水平要比MBP标签高；而融合两种标签的TEVp同义突变体的活性相比在BL21（DE3）表达时没有明显的改善。
　　综上所述，本实验证明在不同温度胁迫下，不同类型的分子伴侣改善TEVp突变体特别是同义突变体的表达水平的作用情况存在明显差异；MBP融合标签可以改善 TEVp氨基酸突变体水溶性和活性，改善效应受到 TEVp识别序列的影响；Trx融合标签改善 TEVp氨基酸突变体的活性不受 TEVp识别序列的影响；提高稀有tRNA丰度及两类融合标签对 TEVp同义突变体的活性并未有较好的改善，暗示了同义突变造成的蛋白质折叠损伤是受基因水平调控的，难以在翻译后水平上被修复。

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1文献综述

1.1密码子偏好性与同义突变

1.2蛋白重组技术

1.3分子伴侣的研究

1.4融合标签技术

1.5 烟草蚀斑病毒蛋白酶

2 引 言

2.1研究目的和意义

2.2 研究内容

3 材料与方法

3.1 材料

3.2 实验方法

4 结果与分析

4.1 载体构建

4.2 与分子伴侣GESP共表达的TEVp突变体表达量及水溶性分析

4.3 与分子伴侣DJKL共表达的TEVp突变体表达量及水溶性分析

4.4 MBP和Trx融合标签对TEVp突变体表达水平和酶学活性的影响

4.5 稀有tRNA丰度对融合MBP和Trx的TEVp突变体表达水平和酶学活性的影响

5 讨 论

5.1 分子伴侣对不同类型TEVp突变体折叠改善的分析

5.2 融合标签对不同类型TEVp突变体折叠改善的分析

5.3 稀有tRNA 丰度对不同类型的突变体折叠改善的分析

6 结 论

参考文献

致谢

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