玉米逆境响应相关基因ZmUBP的功能鉴定与WRKY基因家族进化分析

摘要

玉米是我国种植面积最大的粮食作物。生物与非生物逆境胁迫严重影响玉米的产量和品质，抗逆育种已成为玉米遗传改良的重要方向，因此发掘和研究抗逆相关基因及其功能并进行分子育种，是培育抗逆新品种提高玉米产量和品质的一种有效途径。泛素特异性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Protease, UBP）是一类广泛存在于真核生物中的保守性很高的蛋白，它们通过脱泛素化作用调节生长发育。在植物抗逆过程中，UBP蛋白也有着重要的作用，但迄今关于玉米中该蛋白基因家族的功能还未见报道。本研究通过对玉米基因组ZmUBP家族分析，克隆了玉米中 UBP14， ZmUBP16a，ZmUBP16b和 ZmUBP16c，并对这些基因的功能进行了分析鉴定；同时对玉米及其他禾本科物种中抗逆相关的WRKY转录因子家族进行了分子进化的研究。获得了以下主要结果：
　　1、蛋白质结构域分析表明，ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c均含有UBP结构域。组织表达模式分析显示，它们在玉米生长的各个时期都普遍表达。不同的非生物胁迫处理下，ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c能够响应脱落酸诱导、盐离子及重金属胁迫。通过构建ZmUBP14-GFP和ZmUBP16a/b/c-GFP载体并转化拟南芥，研究 ZmUBP14和 ZmUBP16a/b/c的蛋白定位，结果表明ZmUBP14-GFP融合蛋白定位在细胞核中，ZmUBP16a-GFP，ZmUBP16b-GFP和ZmUBP16c-GFP融合蛋白均定位在细胞膜上。
　　2、通过构建ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c过表达载体，分别转化拟南芥 ubp16功能缺失突变体，结果显示，这三个蛋白均能回补拟南芥 ubp16功能缺失突变体的表型。在拟南芥中分别过表达玉米ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c，分析表明，ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c的过表达并不影响植株的抗盐性，在经100mM NaCl处理后，过表达植株的表型与空载体对照无明显差异；在0.5μM ABA的处理下，过表达植株的发芽率在比空载体对照低了约50％，过表达ZmUBP16a和ZmUBP16b的植株表现出对CdCl2明显的不敏感性；因此说明，过表达 ZmUBP16a，ZmUBP16b和 ZmUBP16c能够提高了拟南芥对ABA的敏感性和对重金属的抗性。
　　3、通过对抗逆相关基因的表达分析，发现逆境条件下， ZmUBP16a， ZmUBP16b和 ZmUBP16c过表达植株中的抗逆功能基因的表达水平显著提高，抗重金属相关基因如AtABCC1，AtABCC2和AtPCS在镉处理后表达量明显高于对照；ABA通路基因以及与ABA合成相关基因（如AtNCED3，AtMYB2，AtRD22）的表达量也明显高于对照植株，而不依赖于ABA的抗逆基因AtCBF表达量变化不大。结果表明，ZmUBP16a, ZmUBP16b和 ZmUBP16c是通过ABA信号转导途径参与离子胁迫应答。
　　4、为进一步确认ZmUBP16a在重金属胁迫下的作用机制，本研究选取了野生型以及 ZmUBP16a过表达植株在金属镉处理前后的植株样品，进行高通量转录组测序，通过表达差异分析发现，ZmUBP16a过表达引起的上调基因中，大部分为代谢相关基因，包括糖代谢、能量代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢，在重金属镉处理后，这些代谢相关基因在过表达和野生型植株中大多呈现下调表达。在过表达和重金属处理都能引起上调表达的有3个功能基因，其中AT1G05680是活性氧（ROS）和植物激素信号转导途径中有重要的作用的基因。
　　5、通过构建ZmUBP14过表达载体，并转化拟南芥ubp14功能缺失突变体。分析结果表明，过表达玉米ZmUBP14基因能够回补拟南芥ubp14功能缺失突变体的表型。利用Pull-down分析技术，发现ZmUBP14和玉米抗逆相关转录因子ZmTCP15a以及ZmTCP15b在体外存在互作；双分子荧光互补（BiFC）技术分析也表明，ZmUBP14分别和 ZmTCP15a/b在植物体内也存在互作关系。因此ZmUBP14可能是与ZmTCP15家族蛋白互作，在逆境应激反应的功能上协同发挥作用。
　　6、在禾本科物种中，重要的抗逆基因家族WRKY转录因子第一亚家族的基因在染色体上呈现出串联复制，并存在着广泛的微共线性关系，54个包含WRKY I基因的37个区段一共可以组装成8个具有共线性的区段组；除此之外，选择压力分析表明，禾本科家族中WRKY I基因的进化历程中，纯化选择起主导作用。

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第一章 文献综述

1.1植物对非生物胁迫的应答机制

1.2 植物抗逆相关蛋白的研究进展

1.3作物抗逆相关基因功能研究方法

1.4研究目的与意义

1.5技术路线

第二章 玉米ZmUBP16和ZmUBP14的鉴定及分子特征

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 玉米ZmUBP16基因的功能分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 玉米ZmUBP14基因的功能分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 玉米及其他禾本科植物WRKY基因家族进化分析

5.1 材料和方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

结论

参考文献

附录A 载体图谱

附录 B玉米UBP蛋白质结构域序列比对

附录C DNA及蛋白质电泳marker图例

附录D 主要缩写词一览表

致谢

作者简介

博士期间发表的主要研究论文