柞蚕小热休克蛋白的免疫学功能及其作用机制研究

摘要

小热休克蛋白（small heat shock protein，sHSP）是一类在不同物种中比较保守的蛋白，其分子量大小一般在12-43KDa。近年来研究发现 sHSP与机体许多功能如细胞通讯、免疫反应、蛋白转运、凋亡、衰老及细胞周期调节等密切相关。同时也和哺乳动物某些疾病的发生如帕金森症、多发性硬化病及恶性肿瘤相关。然而sHSP在昆虫尤其是鳞翅目昆虫的生理功能研究并不多。柞蚕（Antheraea pernyi）是一种常见的绢丝昆虫，不仅具有很高的经济和医用价值，而且柞蚕丝也是纺织工业重要的原料。我们克隆了柞蚕小热休克蛋白20.8（Ap-sHSP20.8）和21.4（Ap-sHSP21.4）的基因序列，并对其免疫学功能及其作用机制进行了探讨。本研究结果主要包括以下四个方面：
　　1.克隆获得了Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4基因序列并构建了原核表达载体。
　　根据家蚕和其他鳞翅目昆虫的 sHSP序列设计引物，经 PCR克隆扩增获得了Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4基因序列。其中Ap-sHSP20.8基因开放阅读框（ORF）为561bp，有187个氨基酸组成，构建系统进化树表明Ap-sHSP20.8属于HSP20家族。而Ap-sHSP21.4基因序列全长1391bp，包括5’端非编码区194bp，由561bp组成编码187个氨基酸的的ORF及3’端633bp的费编码区。系统进化树显示Ap-sHSP21.4在进化关系上距离 HSP20家族较远，可能属于另一进化分支。组织定量显示这两种sHSP在脂肪体分布较高。此外，构建了 pet-28a(+)-Ap-sHSP20.8和pet-28a(+)-Ap-sHSP21.4原核表达载体。采用镍亲和柱进行纯化，制备了多克隆抗体，并在体外验证了 Ap-sHSP20.8分子伴侣功能。为进一步研究 Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的功能奠定了基础。
　　2. Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4对病原微生物的免疫反应。
　　用 E.coli，B.bassiana及 NPV病原微生物注射入5龄3天柞蚕幼虫后，发现Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的基因表达菌明显上调。虽然表达模式不同，但总体来说脂肪体 Ap-sHSP20.8和 Ap-sHSP21.4基因表达上调程度要比中肠明显很多。采用Western blot技术发现，免疫刺激后Ap-sHSP20.8蛋白表达也不同程度地上调。此外，采用 si-Ap-sHSP21.4，基因敲除 Ap-sHSP21.4后，发现免疫相关基因 defensin, Dopa decarboxylase, Toll1, lysozyme和 Kazal-type serine protease inhibitor的表达均明显下调。这些结果表明Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4在柞蚕的免疫系统中具有重要作用。
　　3.类花生四烯酸代谢途径对柞蚕sHSP的调节。
　　由于炎症反应会引起哺乳动物局部体温升高，而这种体温升高和 HSP表达及类花生四烯酸代谢密切相关，昆虫的许多免疫反应机制与哺乳动物类似。鉴于此，我们用类花生四烯酸代谢途径中一些酶的抑制剂处理柞蚕幼虫后，再给予免疫刺激，发现Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的基因和/或表达均明显下调，而花生四烯酸却能使其表达显著增加。表明Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4的免疫功能可能与类花生四烯酸的代谢相关。
　　4.探讨了Ap-sHSP20.8与caspase-1之间的关系
　　多数环境刺激不仅会引起sHSP的表达变化，也影响到细胞凋亡。而caspase酶在细胞凋亡中处于中心地位。采用 RNAi技术把 Ap-sHSP20.8基因敲除后热激， caspase-1的活性升高及基因表达明显升高。表明caspase-1可能是sHSP20.8的下游调节因子。此调节通路尚需进一步的细胞学验证。

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缩略词表

第一章 文献综述

1热休克蛋白的分类

2小热休克蛋白

第二章 柞蚕小热休克蛋白20.8和21.4基因的克隆

1 研究目的及意义

2主要研究内容

3材料与方法

4 结果

5讨论

第三章 小热休克蛋白的原核表达及分子伴侣功能研究

1 研究目的及意义

2主要研究内容

3材料与方法

4 结果

5 讨论

第四章 柞蚕小热休克蛋白的免疫功能研究

1 研究目的及意义

2主要研究内容

3材料与方法

4 结果

5 讨论

第五章 类花生四烯酸代谢途径对柞蚕小热休克蛋白免疫功能的调节

1 研究目的及意义

2主要研究内容

3 实验材料与方法

4 结果

5 讨论

第六章 柞蚕小热休克蛋白对细胞凋亡因子caspase影响

1 研究目的及意义

2主要研究内容

3材料与方法

4 结果

5 讨论

第七章 结论

1. 克隆获得了Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4基因序列

2. Ap-sHSP20.8和Ap-sHSP21.4参与柞蚕对病原微生物的免疫反应

3.类花生四烯酸代谢途径影响柞蚕小热休克蛋白的免疫功能

4. Ap-sHSP20.8可调控caspase-1的表达

参考文献

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