核盘菌蛋白激发子同源物SsPemG1的功能分析

摘要

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种广泛分布的产菌核的死体营养型真菌，严重威胁着油菜生产安全，造成巨大经济损失。由于传统防治手段弊端凸显，从基因水平研究核盘菌致病机理，寻找新一代环保、高效的微生物农药刻不容缓。随着核盘菌全基因组测序完成，核盘菌 DNA转化体系以及 RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术的逐渐成熟，为开展核盘菌功能基因的研究提供便利。
　　植物在长期进化过程中形成了复杂的防卫反应以应对病原微生物的入侵，而蛋白激发子可以刺激植物快速形成程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)阻止病原菌的进一步扩散。因此开展蛋白激发子的研究对于挖掘新型安全、高效的微生物农药意义重大。
　　PemG1(GenBank accession number: EF062504)是一个分离自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的蛋白激发子，对诱导水稻抵御稻瘟病菌的侵染有较好作用。本研究使用稻瘟病菌 PemG1的氨基酸序列对核盘菌全基因组数据库进行Blast_p，找到一个具有相同功能域和较高的序列相似度的蛋白，编码基因SS1G_07345，将其命名为SsPemG1。故可推测SsPemG1可能也是蛋白激发子。
　　本实验通过扩增核盘菌中 SsPemG1编码基因序列，构建出SsPemG1-pSilent-1的沉默表达载体，利用PEG介导的核盘菌原生质体转化实验获得了该基因的沉默突变菌株。通过潮霉素B抗性和荧光定量PCR实验筛选出具有良好的沉默抑制效果的突变菌株M6和M9。通过分析沉默突变菌株的表型差异和生物信息学信息，明确SsPemG1在核盘菌中的功能。
　　表型分析结果表明：在致病性实验中，沉默突变体的致病性明显较野生型强。通过进一步研究发现，沉默突变体比野生型和Mock菌株具有更快的生长速度；对NaCl和SDS的耐受性变的更强；形成更多对于致病性至关重要的侵染垫；细胞壁降解酶类的活性变的更强。SsPemG1通过调控这4个因素共同导致其致病力变强。
　　生物信息学预测结果表明，主要功能是结合 RNA，调节转录和翻译，这与表型实验的结果一致。
　　本实验的开展有助于进一步了解核盘菌SsPemG1的功能，为研究激发子提供一个新的方法，为核盘菌的防治提供理论基础。

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1文献综述

1.1油菜菌核病和核盘菌的研究进展

1.2蛋白激发子的研究进展

1.3生物信息学研究进展

2引言

3材料与方法

3.1供试材料

3.2供试方法

4结果与分析

4.1 SsPemG1基因的克隆和测序

4.2生物信息学预测结果

4.3 SsPemG1基因在核盘菌无性生活史各阶段相对表达分析

4.4 SsPemG1-pSilent-1载体的构建与验证

4.5 SsPemG1沉默转化子的筛选与验证

4.6 SsPemG1沉默突变体生长表型及菌核发育观察

4.7 SsPemG1沉默对形成侵染垫和SsGgt1基因表达的影响

4.8 SsPemG1沉默突变体对五种胁迫因子的耐受性分析

4.9 SsPemG1沉默突变体草酸、果胶酶、纤维素酶及蛋白酶测定

4.10 SsPemG1沉默对核盘菌NGA4致病力的影响

4.11其他致病相关基因的相对表达量的测定

5小结与讨论

5.1全文小结

5.2讨论

参考文献

致谢

附录A 化学试剂和仪器设备

附录B 常用缓冲溶液和培养基

附录C 部分实验步骤

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