基因编辑技术介导的基因删除与替换

摘要

基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术，通过人工构建工程化的核酸酶，对基因组目标区间序列特异性识别与切割，定点切割产生DNA双链断裂(double-stranded breaks，DSBs)并通过细胞内源的同源重组(homologous recombination，HR)或非同源末端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)DNA损伤修复机制，可以在细胞活体基因组DNA序列中产生碱基缺失、插入、替换等修饰的技术。基因编辑技术具有定向突变、效率高、操作简便、特异性强等特点，使其在基因功能鉴定和遗传改良应用上有着重要的意义。基因删除是指引入两个DSBs，基于NHEJ修复将两个分开的DSBs连接起来，实现DSBs之间基因片段的删除。基因替换是在基因删除的基础上，提供修复模板，基于HR途径可以实现任何设计的DNA序列的引入。microRNA(miRNA)是由具有发卡结构的pri-miRNA加工而来的一类小分子RNA，参与生物体转录和转录后水平基因的调控。基因删除可被用于创制miRNA无义突变体以研究其基因功能。本研究基于成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的基因编辑技术在植物中实现基因删除和基因替换，主要研究结果如下:
　　1.基因删除技术体系的建立。以AtMIR169a、AtMIR827a基因座pri-miR169a和pri-miR827a两端序列为目标区域，选取靶位点，构建基于双元向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)介导的CRISPR/Cas9编辑载体。
　　2.基因删除突变体筛选、鉴定与表型分析。通过PCR技术检测筛选基因删除突变体，得出AtMIR169a、AtMIR827a基因座pri-miRNA区域删除效率分别为24％和20％，测序确定其基因型，筛选出纯合删除突变体mir169a和mir827a。Northern blot实验结果表明，纯合删除突变体mir169a中miR169的表达量明显减弱。干旱胁迫处理实验表明，纯合删除突变体mir169a表现为更强的耐旱性。
　　3.基因替换技术体系的设计与建立。基于基因删除技术体系，选取AtTFL1基因部分片段为替换目标区域，选取靶位点，构建基因删除编辑载体。基于HR修复原理，设计两段800bp左右与AtTFL1基因替换目标区域外侧序列一致的同源臂，分别连接到核定位表达盒35S:eGFP:NOS的两端，在两端分别设计和替换目标区域一致的靶位点，构建修复模板载体。
　　4.基因替换突变体筛选、鉴定与表型分析。通过特异性引物对转基因阳性植株进行扩增，筛选出AtTFL1基因部分片段替换突变体，统计得到替换效率为0.8％。筛选出AtTFL1基因部分片段发生替换并且修复模板发生删除的突变体，观察eGFP表达。实验表明，eGFP在拟南芥叶和根中能稳定表达。
　　5.基因删除、基因替换编辑目标突变的遗传。筛选出基因删除杂合植株和基因替换植株，对后代进行鉴定。结果表明，后代植株突变类型符合孟德尔分离定律，基因删除、基因替换编辑目标突变能够稳定遗传。
　　本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以高效的实现植物基因删除并有效的创制出miRNA无义突变体。本研究在基因删除的基础上，基于HR修复原理实现了对AtTFL1特定区域的定点替换。本研究为植物miRNA功能研究和DNA序列替换及修饰提供了新的策略。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 基因编辑技术研究进展

1．1．1 归巢核酸酶技术

1．1．2 锌指核酸酶技术

1．1．3 类转录激活效应因子核酸酶技术

1．1．4 CRISPR／Cas9技术

1．1．5 基因组编辑技术创制突变类型

1．2 miRNA作用机制

1．2．1 AtMIR169a简介

2 引言

2．1 研究目的及意义

2．2 技术路线

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 材料背景

3．1．2 菌种与载体

3．1．3 试剂

3．1．4 仪器设备

3．2 CRISPR／Cas9识别靶位点分析

3．2．1 基因删除系统靶位点选择

3．3．1 基因删除载体构建

3．3．2 质粒转化农杆菌

3．3．3 拟南芥的种植与遗传转化

3．3．4 转基因植株基因组提取

3．3．5 删除突变体筛选及其遗传鉴定

3．3．6 mir169a删除纯合突变体Northern blot实验

3．3．7 mir169a删除纯合突变体干旱胁迫处理与表型鉴定

3．4．1 基因替换系统删除载体构建

3．4．2 基因替换系统修复模板载体构建

3．4．3 载体共转农杆菌

3．4．4 基因替换突变体筛选与鉴定

3．4．5 基因替换突变体eGFP表达鉴定

4 结果分析

4．2 AtMIR169a和AtMIR827a基因删除体系建立与验证

4．2．1 AtMIR169a和AtMIR827a基因删除效率与稳定遗传分析

4．2．2 AtMIR169a和AtMIR827a基因删除突变体基因型分析

4．2．3 mir169a纯合删除突变体Northern blot分析

4．2．4 mir169a纯合删除突变体受干旱胁迫处理及表型鉴定

4．3 AtTFL1基因特定区域替换系统的建立与验证

4．3．1 基因替换突变体的检测

4．3．2 基因替换突变体的筛选

4．3．3 基因替换突变体eGFP表达鉴定

5 讨论

5．1 基因编辑技术在作物育种中的意义

5．2 基于双sgRNA向导的CRISPR／Cas9系统的基因删除体系对于植物miRNA研究的意义

5．3 基于同源重组修复策略的基因替换体系对于基因工程发展的意义

6 结论

参考文献

作者简介

硕士期间发表的研究成果