烟草吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶基因的克隆与分析

摘要

维生素B6(Vitamin B6，VB6)是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称，包括吡哆醇(Pyridoxine，PN)、吡哆胺(Pyridoxamin，PM)、吡哆醛(Pyridoxal，PL)以及它们所对应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5'-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5'-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoal-5'-phos phate,PLP)。其中PLP是细胞内140多种酶的辅酶。动物自身不能合成VB6，其需要从食物中获取各种形式的VB6通过代谢转换途径完成PLP的合成。在自然界中存在两条从头合成途径，一条是DXP依赖途径，另一条是DXP非依赖途径。植物通过DXP非依赖途径合成PLP，PLP在植物体内经过一系列酶的催化作用代谢转换成不同形式的VB6。在这个过程中VB6磷酸酶、PL还原酶、PM-丙酮酸转氨酶、吡哆醛激酶(PLK，Pyridoxal kinase)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO，Pyridoxine5'-phosphate oxidase)起着至关重要的作用。PLK可以将PN、PM和PL磷酸化生成PNP、PMP和PLP,PNPO可以将PNP和PMP氧化生成PLP。
　　植物作为动物的主要食物来源，也是VB6的主要来源。植物体内VB6的代谢转换途径的研究对人体营养素VB6的供给问题具有重要的意义，PLK和PNPO两个关键代谢转换作用酶的研究也尤为必要。在植物拟南芥中已经克隆鉴定出PLK和PNPO并通过T-DNA插入突变在基因表达水平上研究对其他VB6合成代谢转换酶基因表达的影响，但其还缺乏在不同物种和不同方法上的验证。本实验采用模式植物烟草为材料进行PLK和PNPO相关研究，对植物体内营养素VB6的合成和代谢转换具有参考作用。
　　本研究，利用拟南芥PLK和PNPO cDNA序列在烟草EST库中检索，寻找到预测编码烟草NtPLK和NtPNPO的eDNA序列，在Genbank上的登录号分别为XM_009804516.1和XM_009801441.1。以提取的烟草叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板，设计引物对NtPLK和NtPNPO的编码框进行克隆得到预期大小的DNA片段，产物测序结果显示NtPLK的编码框长为1020bp，编码的蛋白含有339个氨基酸，分子量大小为37.4kDa，等电点为6.96。氨基酸序列比对发现相对哺乳动物、昆虫和细菌存在N端延长，酶活性位点处的氨基酸残基和其他物种一样保守。该基因在染色体上跨度1.2kb DNA，含有13个外显子和12个内含子。NtPNPO的编码框长为1620bp，编码的蛋白质含有539个氨基酸，分子量大小为60kDa，等电点为8.03。氨基酸序列比对发现与哺乳动物、昆虫和细菌相比在N端大幅度延长约280个氨基酸残基，该区域主要是YJeF_N功能域，该功能域功能目前尚不清楚。该基因在染色体上跨度0.7kb DNA，含有14个外显子和13个内含子。NtPLK在烟草的叶片中转录表达水平最高，根和茎中转录表达水平较低且比较接近。NtPNPO在烟草的叶片中转录表达水平最高，茎中次之，根中最低。
　　将克隆得到的NtPLK和NtPNPO的编码框序列导入到pET32a(+)表达载体中在Rosetta大肠杆菌中表达出预期蛋白。NtPLK的粗酶液相对于底物PL，显示的吡哆醛激酶的活性为29.7nmolPLP/mg/min。NtPNPO的粗酶液相对于底物PMP，显示的磷酸吡哆醛氧化酶的活性为21.4nmolPLP/mg/min。酶活证实了克隆的序列所编码的蛋白为烟草PLK和PNPO。
　　选取NtPLK的编码框内490bp的特异性的序列和NtPNPO的编码框内497bp的特异性的序列，将其各自的正反向序列分别插入pHANNIBAL中内含子的两端，构建发卡结构的RNAi载体。利用农杆菌EHA105介导侵染烟草叶片，通过qRT-PCR检测显示NtPLK RNAi在烟草叶片中下调NtPLK转录水平表达效果的最佳时间是72h，NtPNPO RNAi在烟草叶片中下调NtPNPO转录水平表达效果的最佳时间是48h。NtPLK RNAi处理后72h，烟草叶片中NtPLK、NtPNPO和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了50.9％、51.1％和26.3％，而NtPLR上升了27.7％;NtPNPO RNAi处理后48h，烟草叶片中NtPNPO、NtPLK、NtPLR和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了68％、22.1％、29.5％和33.9％。证实了构建的RNAi载体成功的下调了目的基因的表达。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 维生素B6简介及其在生物体内韵作用

1．2 VB6的生物合成

1．3 生物体内VB6的代谢转换

1．4 PLK的研究进展

1．4．1 PLK的催化功能和结构特点

1．4．2 植物PLK的研究进展

1．5 PNPO的研究进展

1．5．1 PNPO的催化功能和结构特点

1．5．2 植物PNPO的研究进展

1．6 RNAi简介

2 引言

2．1 研究的目的及意义

2．2 研究内容

3 材料与方法

3．1．3 主要试剂及配方

3．2 实验方法

3．2．2 NtPLK、NtPNPO目的片段的克隆

3．2．3 NtPLK、NtPNPO原核表达载体的构建

3．2．4 表达菌株的诱导表达和表达产物的SDS-PAGE分析

3．2．5 NtPLK、NtPNPO的酶活测定

3．2．6 NtPLK、NtPNPO RNAi载体的构建

3．2．7 农杆菌侵染烟草叶片

3．2．8 荧光定量检测

4 结果与分析

4．1 烟草PL激酶、PNP氧化酶基因的克隆

4．1．1 烟草NtPLK和NtPNPO cDNA序列的分析预测

4．1．2 RNA检测结果

4．1．3 PCR扩增结果

4．1．4 NtPLK和NtPNPO的克隆与测序结果

4．1．5 NtPLK与NtPNPO基因结构

4．1．5 PLK与PNPO多序列比对

4．2 NtPLK和NtPNPO的原核表达

4．3 NtPLK与NtPNPO活性测定

4．4 NtPLK和NtPNPO组织表达差异性分析

4．5 NtPLK和NtPNPO RNAi载体的构建

4．5．2 干扰片段的PCR扩增

4．5．3 NtPLK和NtPNPO RNAi重组质粒的构建和鉴定

4．6．2 NtPLK和NtPNPO RNAi对其它VB6合成和代谢转换酶基因表达的影响

5 讨论

5．3 NtPLK和NtPNPO基因RNAi效果

5．4 NtPLK和NtPNPO RNAi对其它VB6合成和代谢转换酶基国表达的影响

6 结论

参考文献

作者简介