茶树根系跨膜吸收氟的微观机制和转录组学特征

摘要

茶树是氟(fluorine，F)超量富集植物，茶树叶片F含量高达每千克几百至上千毫克，比一般植物高2个数量级。F主要在茶树叶部积累，占其富积总量的90％以上，尤以老叶含量最高。茶叶中的F大约有40％～90％可被溶解到茶汤中，饮茶成为人体摄取F的重要途径之一。根系是茶树吸收F的主要器官，吸收多寡则与土壤F进入根系的途径有关。明确茶树根系吸收富集F的微观过程和分子机理对于调控茶树对F的吸收富集，保障茶叶质量安全具有重要意义。
　　本文系统研究了Cl-、低温、代谢抑制剂对茶树根系吸收F的影响;分析了质膜H+-ATPase在茶树跨膜中的作用，初步剖析了茶树根部跨膜吸收F/Cl的转录组学特征及其差异，为揭示茶树高量富集F的微观机制提供理论依据。
　　(1)从确定茶树吸收F离子所需要的最适宜时间(0-96h)看，在0-96h的处理时间范围内，茶树吸收F呈现出快速(0-24h)和缓慢(48-96h)两个吸收阶段。根系F含量在72h时呈现出最高值，为262.7mg/kg。本实验中把72h作为茶树根系吸收F的最佳吸收时间。
　　(2)从确定茶树吸收F离子所需要的最适宜浓度(0-5mM)看，随着NaF浓度的增加，茶树根系F吸收速率逐渐升高。当NaF浓度为5mM时，茶树根系F的吸收速率为最高值，并满足动力学方程，Vmax=13.9μg·h-1·g-1(Root Dry weight，DW)，Km=0.59mM。本实验选择NaF浓度为5mM作为最佳吸收浓度。
　　(3)从低温(4℃)、C1-、代谢抑制剂(2，4-DNP、NaN3和Na3VO4)等对茶树根系吸收F的影响看，低温削弱了茶树根系对F离子的吸收能力，F含量降低了49.8％。代谢抑制剂2，4-DNP、NaN3和Na3VO4显著抑制了茶树根系对F的吸收，在2，4-DNP、NaN3和Na3VO4浓度分别为1mM、0.2mM、0.6mM时，F吸收量最少，分别比对照降低了16.08％、39.95％和20.56％。当加入5mM的NaC1时，C1-明显降低了茶树对F的吸收，降低率为73.1％，说明CI对茶树根系吸收F-存在竞争作用。
　　(4)NMT(非损伤微测技术)和质膜H+-ATPase活性的研究结果显示:当加入5mM NaF时，H+外排从最初的-217.11pmol·cm-2·s-1逐渐减少，稳定状态时达到-73.51pmol·cm-2·s-1，说明NaF激活了质膜H+-ATPase的活性，使质膜活性升高了178.99％，从而促进了茶树根系对F离子的吸收，使得F含量增加了20.63％;当加入Na3VO4时，H+内流从最初的-206.50pmol·cm-2·s-1逐渐减少，稳定时达到-92.58pmol·cm-2·s-1，说明Na3VO4抑制了质膜H+-ATPase的活性，抑制率为77.15％,从而降低了茶树根系对F离子的吸收，抑制率为48.42％。
　　(5)利用Illumina Hiseq平台，研究了茶树吸收F/C1时的转录组学特征，获得了53.92Gb个数据，组装去冗余后得到272628个Unigene，总长度、平均长度、
　　N50以及GC含量分别为216476384bp，794bp，1483bp和40.81％。将Unigene比对到七大功能数据(蛋白非冗余数据库(Non-redundant Pprotein Database，Nr)、核苷酸集合数据库(Nucleotide Collection，Nt)、蛋白质系列数据库(Swissprot Protein Sequence Database，Swissprot)、直系同源聚类分析(Cluster of Orthologous Group，COG)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、基因本体论(Gene Ontology，GO)、以及蛋白质组分析数据库(Interpro))库进行注释，最终分别有129064(Nr:47.34％)、131735(Nt:48.32％)、85155(Swissprot:31.23％)、55935(COG:20.52％)、97526(KEGG:35.77％)、56947(GO:20.89％)以及81615(Interpro:29.94％)个Unigene获得功能注释。根据注释结果共检测出127713个CDS，未注释上的Unigene使用ESTScan预测后获得22076个CDS，同时预测出3374个编码转录因子的Unigene。茶树跨膜吸收F/C1过程中与膜转运有关的差异基因有97条，上调基因有ABCA3，ABCB1，ABCB9，ABCB10，ABCC1，ABCC2，ABCC10，ABCG2，其中具有底物特异性结合的功能的ABCG2转运蛋白基因上调倍数最高，为6.6倍，下调基因有ABCB1/TAP，ABCC1，ABCC2，ABCG2，其中具有运载蛋白体的功能ABCB1/TAP转运蛋白基因下调倍数最高，为4.7倍。

目录

声明

致谢

摘要

缩写和符号清单

1 文献综述

1．1 茶树体内F的来源

1．1．1 土壤中的F

1．1．2 水环境中的F

1．1．3 大气环境中的F

1．2 茶树生长所需的土壤环境

1．2．1 土壤酸碱度

1．2．2 土壤质地

1．2．3 土壤厚度

1．2．4 土壤养分

1．3 茶树生长所需的气象条件

1．3．3 光照

1．4 调控F的措施

1．4．1 调控土壤F有效性的措施

1．4．2 降低茶叶和茶汤中F的措施

1．5．1 植物根系吸收离子的过程

1．5．2 植物根系吸收离子的影响因素

1．6 质膜H+-ATPase在植物吸收离子过程中的作用

1．7 茶树中转录测序的研究现状

1．8 研究主要内容

1．8．1 茶树吸收F的最佳环境条件研究

1．8．5 茶树根系跨膜吸收F／Cl的转录组学特征研究

1．9 技术路线

2 引言

3 材料与方法

3．1 材料

3．1．1 供试样品

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．2 确定茶树最适宜吸收的环境条件

3．2．3 Cl-对茶树根系吸收F的影响

3．2．4 低温、代谢抑制剂对茶树根系吸收F的影响

3．2．5 质膜H+-ATPase酶活测定

3．3．2 微粒体和质膜的分离

3．3．3 蛋白质测定

3．3．4 H+-ATPase活性的测定

3．3．5 H+／Cl-流速的测定

3．3．6 茶树转录组的测序分析

3．4 数据处理

4 结果与分析

4．1 茶树根系吸收F的时间效应

4．2 茶树根系吸收F的浓度效应

4．3 Cl-对茶树根系吸收F的影响

4．4 低温对茶树根系吸收F的影响

4．5 代谢抑制剂对茶树吸收F的影响

4．5．1 2，4-DNP对茶树根系吸收F的影响

4．5．2 NaN3对茶树根系吸收F的影响

4．6．2 Na3VO4对茶树根系质膜H+-ATPase活性的影响

4．6．3 H+flux

4．7 茶树跨膜吸收F／Cl的转录组学差异

4．7．1 Unigene的质量指标

4．7．2 Unigene功能注释

4．7．3 Unigene的CDS(编码DNA序列)预测

4．7．4 Unigene的TF(转录因子)编码能力预测

4．7．5 差异表达基因检测

4．7．6 差异基因的GO功能分类

4．7．7 差异基因的Pathway(生物学通路)分类

4．7．8 茶树跨膜转运过程中参与的转运蛋白通路

5 讨论

5．2．3 Na3VO4对茶树根系吸收F的影响

5．4 茶树根系中F／Cl的转录组测序

6 结论

6．1 茶树吸收F的特性

6．2 H+-ATPase在茶树跨膜过程中的作用

6．3 F／Cl转录组差异

参考文献

附录

个人简介

攻读硕士学位期间所发表论文

硕士期间所获奖项