大豆疫霉延胡索酸还原酶PsFRD基因克隆与功能分析

摘要

随着全球大豆产量的增加，有关大豆疫霉引起的大豆疫病的报道也屡见不鲜。大豆疫霉（Phytophthora sojae）是大豆上的毁灭性病害，能导致大豆的减产，该病害最早于1948年在美国报道，并随后迅速跃升为影响大豆生长的重要病害之一。
　　延胡索酸还原酶(fumarate reductase;FRD）在较低等的真核生物和微氧或厌氧环境中生存生物的线粒体中扮演厌氧能量代谢的作用，其与线粒体中复合体Ⅱ黄素蛋白亚基中黄素腺嘌呤二核苷酸辅基FAD结合，催化延胡索酸还原为琥珀酸，与琥珀酸脱氢酶的还原反应互为逆反应，是三羧酸循环和线粒体呼吸链的重要组成部分。
　　本学位论文主要开展大豆疫霉延胡索酸还原酶基因（Fumarate reductase，PsFRD）的功能及作用研究。对大豆疫霉延胡索酸还原酶基因PsFRD进行克隆试图揭示大豆疫霉PsFRD与大豆疫霉致病机制的关系，为新型高效的靶标性生物农药研究提供理论依据。试验得出以下结论:
　　(1)利用报道的致病疫霉FRD序列在NCBI网站进行序列比对，得到大豆疫霉的基因PsFRD序类。对PsFRD的氨基酸序列进行蛋白结构预测构结果显示其含有一个FAD_binding_2保守结构域。构建的系统进化树表明，与寄生性水霉（Saprolegnia parasitica）等水霉属，虾瘟真菌（Aphanomyces astaci）等丝囊霉属的PsFRD蛋白聚在一类，亲缘关系最近。而相对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）等陆生植物亲缘关系较远。ExPASy在线网站中蛋白预测发现，PsFRD是一种亲水蛋白，结构稳定且不具跨膜结构。
　　(2)利用qRT-PCR技术检测PsFRD在不同时期的表达量。发现在游动孢子和游动孢子囊期PsFRD的表达量低于菌丝期和休止孢萌发期。在菌丝侵染24h后，PsFRD的表达量最高为1.58。
　　(3)成功构建PsFRD-PTOR-GFP瞬时表达载体，获得突变体5株。选取突变体中PsFRD表达量相对于p6497表达量的0.3和0.5倍的N3，N5做后续试验。
　　(4)对沉默突变体N3，N6进行抗逆境胁迫试验，在3nmol/L H2O2V8培养基上N3，N6菌株5d的菌丝生长长度分为1.79cm和2.38cm是野生型WT4.49cm的39.87％和53％。在0.7mol/LNacl培养基上N3，N6菌株5d的菌丝生长长度分为:1.83cm和2.12cm是野生型WT2.87cm的63.76％和73.87％。试验表明突变体相对于P6497的耐盐性，耐活性氧的能力有所下降。
　　(5)对PsFRD沉默突变体进行致病力测定，包括利用PsFRD沉默突变体侵染感病品种和丰47离体叶片和活体下胚轴接种试验。发现突变体不管在离体叶片上和活体的大豆上都表现出相对于野生的P6497菌株较弱的致病力，表现为在侵染大豆叶片60h后N3、N6菌株病斑面积占整个叶片面积百分比约分别为2.07％和2.81％，而WT病斑为62.88％。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 卵菌概述

1．2 疫霉概述

1．2．1 疫霉的分类及研究

1．2．2 疫霉的生活史

1．3 大豆疫霉发生及其防治

1．3．1 大豆疫病的危害、流行

1．3．2 大豆疫霉的致病机制

1．3．3 大豆疫病的防治

1．4 RNA interfering(RNA干扰；RNAi)技术在大豆疫霉研究上的应用

1．4．1 RNAi现象的发现

1．4．2 RNAi机制

1．4．3 大豆疫霉基因组学

1．4．4 RNAi技术在大豆疫霉研究上的应用

1．5 延胡索酸还原酶研究进展

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 供试菌株和载体

3．1．2 供试大豆

3．2．1 供试方法

3．2．2 大豆疫霉PsFRD生物信息学预测

3．2．3 大豆疫霉延胡索酸还原酶(PsFRD)目的片段的扩增

3．2．4 PsFRD各个生活史阶段和侵染阶段的转录的表达分析

3．2．5 PsFRD-PTOR-GFP(PsFRD与PTOR-GFP载体反向酶连)瞬时沉默表达载体的构建

3．2．6 PEG介导大豆疫霉原生质体转化

3．2．7 转化子的筛选及qRT-PCR分析PsFRD表达量

3．2．8 PsFRD沉默转化菌株的表型分析

3．2．9 PsFRD沉默转化菌丝及游动孢子囊生长状况

3．2．10 PsFRD沉默转化菌株的致病性分析

4 结果与分析

4．1．2 PsFRD蛋白基本性质

4．1．3 多序列比对及系统发育树构建

4．2 PsFRD各个生活史阶段和侵染阶段的转录的表达分析

4．3 PTOR-GFP-PsFRD沉默载体的构建及转化子的获得

4．4 PsFRD沉默转化菌株的表型分析

4．5 PsFRD沉默转化菌丝及游动孢子囊生长状况

4．5．1 PsFRD沉默转化子菌丝生长差异

4．5．2 PsFRD沉默转化子游动孢子囊形成差异

4．6 PsFRD沉默转化菌株的致病性分析

5 小结与讨论

参考文献

附录

作者简介