蚕蛹蛋白复合氨基酸的提取及其体外抗肝癌作用的研究

摘要

目的：探讨蚕蛹蛋白、蚕蛹蛋白复合氨基酸的最佳提取条件，并研究蚕蛹蛋白复合氨基酸在体外对人肝癌细胞的抑制作用。
　　 方法：以柞蚕蛹为原料，石油醚为脱脂溶剂，采用碱溶液浸提法提取蚕蛹蛋白，运用单因素试验对固液比、浸提时间、温度3个提取条件进行优选。提取出的蚕蛹蛋白经双氧水进行脱色、除臭，得到黄色无臭味蚕蛹蛋白粉，采用凯氏定氮法测定蛋白的含量。将蚕蛹蛋白用胃蛋白酶水解后再经酸水解来制取蚕蛹蛋白复合氨基酸。通过单因素试验探讨了酶水解时的底物浓度、pH值、酶浓度、水解温度及水解时间与水解率的关系，采用正交试验L16(45)优选酶水解的工艺条件。经减压蒸馏、中和、脱色等处理得到黄色澄清的蚕蛹蛋白复合氨基酸。以SMMC-7721细胞株为模型，研究蚕蛹蛋白复合氨基酸体外对人肝癌细胞的抑制作用。经MTT法检测药物对人正常肝脏细胞株QSG-7701的毒性后，计算药物安全浓度。将蚕蛹蛋白复合氨基酸配制成浓度为10－3mg/ml、10－2mg/ml、10ˉ1mg/ml、1mg/ml和10mg/ml，分别与人肝癌细胞SMMC-7721共同培养，同时设空白对照组和细胞对照组。每组设5个复孔，每孔加入细胞浓度为4×104个/ml的细胞悬液100ul，分别培养24、48、72h。采用MTT法测定OD值，评定蚕蛹蛋白复合氨基酸对肝癌细胞株的抑制作用；经Hoechst33258(10mg/L)染色和倒置显微镜进行形态学观察以检测细胞凋亡率；流式细胞法测定细胞周期和Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡。
　　 结果：以石油醚为脱脂溶剂，提取蚕蛹蛋白的脱脂条件为固液比1:4，温度50℃，时间4h。重复4次，脱脂率达到96％以上，所得蛋白粉的蛋白含量为83.5％，蛋白回收率为32.59％。胃蛋白酶水解蚕蛹蛋白的最佳酶解工艺条件为：底物浓度为1:5，pH值4.0，酶浓度1.5％，水解温度60℃，水解时间5h。酶解后再经盐酸水解，其水解率可达到70％左右。所得溶液中氨基酸总量为2.241g/L，其中必需氨基酸含量为0.835g/L，占氨基酸总量的37.26％。细胞毒性实验表明：蚕蛹蛋白复合氨基酸的最大无毒浓度为10mg/ml。不同浓度的蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC-7721细胞24、48和72h后，各用药组的细胞生长抑制率分别为9.0％～53.5％、12.4％～63.4％和16.8％～70.4％。各组与细胞对照组相比，OD值的差异有显著性（P＜0.05），并显示出对剂量和时间的依赖性。作用24、48、72h后，蚕蛹蛋白复合氨基酸对SMMC-7721细胞的IC50分别为4.691mg/ml、1.469mg/ml和0.451mg/ml。Hoechst33258(10mg/L)染色和流式细胞术结果表明，随着剂量的加大，蚕蛹蛋白复合氨基酸能明显促进SMMC-7721细胞的凋亡。
　　 结论：蚕蛹蛋白主要是球蛋白，部分溶于水和稀酸中，在碱性溶液中溶解度最大，故碱性溶液浸提法提取蚕蛹蛋白能有效的提高蛋白得率。运用酶水解与酸水解相结合的方法来水解蛋白，同时具有了酶法的所需条件温和，酶用量少，氨基酸破坏少和酸水解法的水解彻底等特点，所得复合氨基酸中氨基酸种类齐全，必须氨基酸含量高。MTT法、Hoechst33258染色和流式细胞术可以得出蚕蛹蛋白复合氨基酸在体外对SMMC-7721细胞株有一定的抑制作用。蚕蛹蛋白复合氨基酸毒性较小，具有良好的运用前景。