泥鳅Fads2基因克隆、表达分析及其过表达Fads2泥鳅的构建研究

摘要

多不饱和脂肪酸（polyunsaturate fatty acids, PUFAs）是人体生命活动中不可或缺的营养物质，具有维持细胞的结构和机能完整性、增强免疫系统的作用。脂肪酸去饱和酶Fads2（fatty acid desaturase2）是合成PUFAs中的关键性的基因，而泥鳅作为一种富含多不饱和脂肪酸的水产动物，研究泥鳅去饱和酶在多不饱和脂肪酸合成的作用机制具有重要的理论价值和现实意义。因此，本研究以泥鳅为研究对象，首先，通过RACE技术克隆得到Fads2基因的全长，并进行生物信息学的分析。其次，构建泥鳅自身的β-actin启动子，利用双荧光素酶测定启动子活性。最后，成功构建重组载体并得到过表达Fads2泥鳅。其主要的研究结果如下：　　1 Fads2序列及表达分析　　Fads2基因的cDNA全长1736 bp，其中5'非编码区长142 bp，3'非编码区长259 bp，ORF长1335 bp，编码444个氨基酸，具有典型的去饱和酶特征：3个组氨酸保守区，一个N端细胞色素b5结构域及一个血红素结合的HPGG结构域。荧光定量PCR结果显示，脂肪酸去饱和酶Fads2基因在泥鳅多个组织中均有表达；而随着胚胎的不断发育，Fads2基因的表达量不断升高。　　2β-actin启动子的生物信息学分析　　通过 PCR技术和染色体步移技术克隆得泥鳅β-actin启动子序列，并对其进行生物信息学分析，发现在转录起始位点（+1）上游的-88 bp、-55 bp、-24 bp分别有CAAT-box、CArG motif和TATA-box三个转录元件，此外还发现许多重要的转录因子结合位点，如IRF，SP1，E2F，SRF等。通过对不同物种之间的β-actin基因的近端启动子序列进行比对分析，发现泥鳅β-actin近端启动子具有高度保守性。　　3β-actin启动子缺失体的构建与活性分析　　构建了3个不同长度的启动子缺失体 pGL3-β-actinP-0（+70~+1039）， pGL3-β-actinP-1（-426~+1039），pGL3-β-actinP-2（-908~+1039），以 pGL3-basic质粒作为阴性对照，将它们分别转染进Hela细胞中，24h后测定荧光素酶的活性。双荧光素酶检测结果显示：与阴性对照转染组相比，3个启动子缺失体质粒转染组的荧光素酶活性均明显升高，其中 pGL3-β-actinP-1质粒转染组的荧光素酶活性最高，说明启动子缺失体在pGL3-β-actinP-1（-426~+1039）包含核心启动子区。　　4过表达Fads2泥鳅的构建研究　　基于上述实验结果，用 Fads2片段和β-actin启动子构建过表达载体p-β-actin-Fads2-IRES2-EGFP，显微注射到泥鳅的受精卵中，在泥鳅仔鱼体内观察到绿色荧光，该结果表明泥鳅β-actin基因近端启动子片段具有有效的启动功能，为下一步研究脂肪酸去饱和的作用机制奠定基础。

目录

声明

缩略语表

第一章 引言

1多不饱和脂肪酸的研究进展

2脂肪酸去饱和酶的研究进展

3本研究的研究意义

第二章 泥鳅Fads2基因的克隆与表达研究

1前言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5 小结

第三章 泥鳅β-actin基因启动子的克隆及其活性分析

1前言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5小结

第四章 过表达Fads2泥鳅的构建研究

1前言

2材料和方法

3结果与分析

4讨论

5小结

参考文献

附录

致谢