pIRES-Ag85A-ESAT6抗结核二价DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

摘要

目的
　　通过以pIRES质粒为载体构建可同时独立表达Ag85A和ESAT6两种抗原的抗结核二价DNA疫苗，并经体外实验评价其免疫原性及免疫效应，为新型结核疫苗的研发提供新的思路和实验基础。
　　方法
　　1.根据GenBank报道的目的基因（Ag85A和ESAT6基因）全长序列和pIRES质粒酶切位点的特点，利用DNAClub及Premier Primer5软件设计特异性引物。以结核杆菌标准株H37Rv的DNA为模版，经PCR扩增Ag85A和ESAT6基因，分别用限制性内切酶NheⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ、EagⅠ对扩增产物和pIRES空质粒双酶切，经连接酶连接，构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒，并经菌液PCR、质粒双酶切和质粒测序鉴定。
　　2.pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒鉴定构建成功后，转入DH5α菌株，筛选重组质粒，并用质粒小提试剂盒分离纯化质粒DNA。
　　3.将重组质粒采用脂质体法转染至RAW264.7细胞，于5％ CO2培养箱中，37℃，培养24～48h后，western blot法检测质粒蛋白表达情况。
　　4.大量提取重组质粒，经三次肌肉注射质粒免疫BALB/c小鼠，每次间隔2w，末次免疫2w后，取小鼠血清，用ELISA法检测血清中抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体情况。
　　5.同时无菌取小鼠脾细胞在Ag85A和ESAT6蛋白刺激下培养，用ELISA法检测培养液中细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）分泌情况。
　　结果
　　1.成功构建pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒，经PCR鉴定、质粒双酶切，DNA凝胶电泳后，分别出现1017bp和288bp的条带，与Ag85A和ESAT6的理论值相符，并经测序进一步鉴定构建成功。
　　2.分别将用三种浓度的pIRES-Ag85A-ESAT6重组质粒转染至RAW264.7细胞后，经western blot鉴定证实了Ag85A和ESAT6两种蛋白可在细胞内成功表达，且表达水平与转染剂量存在正相关。
　　3.ELISA法检测免疫小鼠血清中抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体变化情况，发现转染了pIRES-Ag85A-ESAT6质粒的二价疫苗组，相应的抗Ag85A抗体和抗ESAT6抗体明显升高，(P＜0.05)，且IgG2a抗体升高明显。
　　4.在细胞因子检测中，pIRES-Ag85A-ESAT6质粒组的IFN-γ、 IL-2水平显著升高(P＜0.05)，而IL-4的值均较低，组间无显著差异性。
　　结论
　　1.pIRES-Ag85A-ESAT6 DNA疫苗，能够在真核细胞中独立表达Ag85A和ESAT6两种抗原。
　　2.pIRES-Ag85A-ESAT6 DNA疫苗可诱导小鼠强烈的特异性免疫应答，且以Th1优势免疫应答为主。
　　3.pIRES-Ag85A-ESAT6 DNA疫苗较单一Ag85A或ESAT6疫苗特异性免疫应答强。

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引言

第一部分 独立表达Ag85A与ESAT6的抗结核二价DNA疫苗的构建

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二部分 Ag85A和ESAT6抗结核二价DNA疫苗免疫效应研究

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介及读研期间主要科研成果

在读期间参与撰写的文章