山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定及功能研究

摘要

牛和羊是重要的节粮型畜种，可为人类提供肉、奶、皮、毛等优质的畜产品。然而，牛是单胎动物，羊是少（寡）胎动物，自然繁殖力低是制约这两种动物生产经济效益的主要原因。因此，研究牛羊繁殖基础理论，开发提高牛羊繁殖力的育种和繁殖新技术具有重要意义。　　 培育繁殖力高的新品种是提高牛羊繁殖力的重要手段，分析牛羊繁殖性状分子遗传规律和调节机制，开发分子标记辅助选择技术，是培育新品种的基础。牛羊繁殖性状是重要的经济性状，也是复杂的数量性状，受微效多基因控制，同时也受一个或几个主基因控制，筛选鉴定繁殖性状主基因并阐明其作用机制，研究其对卵泡发育的调控作用，对于开发提高牛羊繁殖力的新技术（如胚胎工程、繁殖控制等），建立分子育种技术（如标记辅助选择、转基因育种等），快速改良和提高牛羊繁殖性能具有重要的理论和实际意义。　　 本研究从检测主要生殖激素、次要生殖激素和细胞因子基因多态性着手，分析多态性与产羔数、卵泡发育、精液品质之间的关系，鉴定牛和羊主要繁殖性状主基因，并利用RNA干扰技术鉴定主基因功能，探讨其作用机制，为建立高繁殖力牛羊繁殖和育种新技术奠定理论基础，提供技术支撑。　　 1．山羊产羔和牛精液品质与卵泡发育性状主基因鉴定　　 利用候选基因法，采用PCR-SSCP、PCR-RFLP和Forced PCR-RDLP等技术，分析了FecB、FecX（包括FecXI、FecXH、FecXB和FecXG）、与FecB和FecX连锁的5个微卫星标记（BMS2508、OARHH35、BM143、BM1329和TGLA68）、GH和INHA在6个山羊品种/群体（波尔山羊、海门山羊、黄淮山羊、马头山羊、努比山羊和波淮杂交一代羊）共计614个样本中的多态性，及候选基因或微卫星多态性对山羊产羔和生长性状的影响，鉴定山羊产羔性状主基因，筛选相关分子标记；同时采用PCR-RFLP技术研究了INHβA在荷斯坦种公牛中的多态性，及其对精液品质性状的影响，筛选分子标记，并鉴定荷斯坦种公牛精液品质性状主基因，发现：　　 （1）绵羊繁殖性状主基因FecB（BMPR-IB突变体）、FecX（包括FecXI、FecXH、FecXB和FecXG，均为BMP15突变体）在波尔山羊、海门山羊、黄淮山羊、马头山羊、努比山羊和波淮杂交一代6个品种/群体共计614只羊中不存在多态性，即山羊BMPR-IB的突变体FecB和BMP15的突变体FecX不是山羊产羔性状主基因；　　 （2）与FecB（BMPR-IB突变体）连锁的4个微卫星座位（BMS2508、OARHH35、BM143和BM1329）及与FecX（BMP15突变体）连锁的微卫星座位（TGLA68）在山羊中存在多态性，且不同基因型对波尔山羊产羔数性状影响显著；说明BMPR-IB和BMP15是山羊产羔性状主基因，在这两个基因中可能存在除FecB和FecX外的其他主效位点控制山羊产羔性状；　　 （3）在波尔山羊GH基因中检测到2个SNPs（A781G和A1575G），在A781G位点检测到AA和AB两种基因型，BB基因型缺失，在A1575G位点检测到CC和CD两种基因型，DD基因型缺失；GH基因对波尔山羊的基因效应存在性别差异，对波尔山羊公羊早期生长性状调控作用显著，是波尔山羊公羊生长性状主基因，但对母羊早期生长性状调控作用不明显；波尔山羊母羊GH基因型间产羔数无统计差异（p>0.05）；GH是否对山羊产羔数有直接调控作用，尚需进一步研究；　　 （4）在山羊抑制素α亚基基因（INHA）中共检测到11个遗传多态，分别为-506->G、-446C>T、155C>T、-65G>C、129G>A、567G>A、651．A>G、792T>C、906C>T、911T>C、946A>C，其中，911T>C和946A>C分别引起该处氨基酸编码改变，即299　　 Val>Ala和311Thr>Pro；-446C>T、651A>G和946A>C位点对不同山羊品种产羔数性状影响显著；INHA基因是山羊产羔性状主基因；　　 （5）在荷斯坦种公牛抑制素βA亚基基因（INHβA）中发现StyⅠ-RFLP多态性，检测到．AA、AB和BB三种基因型，其中AB基因型是优势基因型；性状关联分析结果表明，INHβA对荷斯坦种公牛精液品质有显著影响，不同基因型对精液品质效应表现为：AB>AA>BB；INHβA是控制荷斯坦种公牛精液品质的主基因。　　 2主基因INHA对牛卵泡发育调控机制研究　　 在候选基因研究基础上，利用RNAi技术进一步研究繁殖性状主基因抑制素α亚基基因（INHA）对牛卵泡细胞生长、凋亡和类固醇激素分泌水平的作用及作用机制，并探讨了INHA对卵泡发育和排卵的局部调节作用，发现：　　 （1）所构建的四种重组干扰质粒（psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3和psiRNA4）均能有效降低INHA表达量，其中psiRNA3重组质粒干扰效果最显著；　　 （2）利用RNAi技术干扰INHA，牛颗粒细胞凋亡抑制基因bcl-2和bcl-xl表达量上调，凋亡促进基因Bax表达量下调，细胞因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ表达量上调；牛颗粒细胞凋亡减少；细胞周期变化显著，GO/G1期颗粒细胞比例减少，S期和G2/M期颗粒细胞比例增加；雌二醇和孕酮水平上调，雌二醇/孕酮比值下调；这些结果说明，抑制素可能通过调控凋亡家族（bc1-2家族）、细胞生长因子（IGF家族）相关基因表达量和类固醇激素分泌量，发挥其在卵巢内部的局部调节作用，抑制颗粒细胞增殖，促进颗粒细胞凋亡，从而抑制卵泡发育和排卵。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 文献综述

1动物繁殖调控

1.1生殖激素调控

1.2次要生殖激素调控

1.3细胞因子调控

1.4基因调控

2主基因鉴定方法

2.1统计分析法

2.2基因组扫描法

2.3候选基因法

3主基因功能研究方法

3.1基因转导法

3.2基因敲除法

3.3基因敲入法

3.4 RNA干扰方法

4牛羊繁殖性状候选基因研究进展

4.1 FecB

4.2AecX

4.3 GH

4.4 INHA

4.5 INGβA

5研究目的和意义

第二章 山羊FecB和FecX基因及其连锁的微卫星座位多态性分析

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计分析

3结果与分析

3.1基因组DNA提取质量

3.2 FecB基因多态性

3.3 FecX基因多态性

3.4与FecB和FecX连锁的微卫星座位多态性

4讨论

4.1 FecB与FecX基因不是山羊繁殖性状主基因

4.2与FecB和FecX连锁的微卫星座位与山羊繁殖性状有关

5 小结

第三章 波尔山羊生长激素基因多态性及对生长和繁殖的调控

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计分析

3结果与分析

3.1 GH基因多态性

3.2 GH基因频率及基因型频率分布

3.3波尔山羊公羊GH各基因型早期生长性状

3.4波尔山羊母羊GH各基因型早期生长性状

3.5波尔山羊母羊GH各基因型产羔数

4讨论

4.1 GH基因部分基因型缺失

4.2 GH对早期生长性状效应的性别差异

4.3 GH基因对波尔山羊母羊繁殖性状的影响

4.4波尔山羊生长性状与繁殖性状的相互关系

5 小结

第四章 山羊抑制素α亚基基因多态性及对产羔数的影响

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计分析

3结果与分析

3.1 1NHA基因PCR-SSCP多态性

3.2 INHA基因SNPs位点

3.3 INHA基因型频率和基因频率分布

3.4山羊INHA各基因型产羔数

4讨论

4.1 INHA是山羊繁殖性状主基因

4.2 INHA效应在不同品种间存在差异

4.3 INHA与山羊繁殖性状标记辅助选择

4.4候选基因法鉴定主基因功能

5 小结

第五章 牛抑制素βA亚基基因多态性及其对精液品质的影响

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计分析

3结果与分析

3.1.INHβA基因PCR扩增产物

3.2 INHβA基因PCR-RFLP多态性

3.3 INHβA基因型频率和等位基因频率

3.4荷斯坦种公牛INHβA各基因型精液品质性状

4讨论

4.1荷斯坦种公牛INHβA基因多态性影响精液品质

4.2 INHβA基因是荷斯坦种公牛精液品质性状主基因

5小结

第六章 繁殖性状主基因INHA对牛卵泡细胞发育的作用及作用机制研究

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计分析

3结果与分析

3.1 INHA基因RNAi重组质粒

3.2重组质粒psiRNA转染牛颗粒细胞

3.3颗粒细胞总RNA质量

3.4 RNAi后颗粒细胞6个基因相对表达量

3.5 RNAi后颗粒细胞凋亡情况

3.6 RNAi后颗粒细胞细胞周期

3.7 RNAi后颗粒细胞类固醇激素分泌量

4讨论

4.1抑制素RNAi效果显著

4.2抑制素促进牛颗粒细胞细胞凋亡的作用及作用机制

4.3抑制素对卵泡发育的局部调节作用及作用机制

4.4抑制素对卵泡闭锁的局部调节作用及作用机制

4.5抑制素对发情和排卵的作用及作用机制

4.6抑制素对卵巢功能的局部调节作用及作用机制

4.7抑制素在动物繁殖领域及人类辅助生殖和卵巢疾病治疗中的应用及应用前景

5小结

结 论

研究创新点与不足

参考文献

附录

致谢