利用PCR-DGGE技术分析病死猪堆肥过程中的微生物群落结构和种类特征

摘要

集约化养殖业迅猛发展的同时，也造成来自畜禽粪便、污水以及病死畜禽残体的严重污染。相对于畜禽粪便对环境的污染，死畜禽由于携带大量的病原微生物，如果不及时处理，对人和动物的危害更大更直接。据统计，养殖场的畜禽死亡率在5％～10％之间，而生猪的死亡率在8％～12％之间，遇到重大疫情，死亡率还会升高。因此，对死畜禽进行无害化处理是解决环境污染，实现畜牧业良性发展的必由之路。　　堆肥是一个可被生物降解的有机质堆，通过好氧微生物分解成稳定的、类似土壤的腐殖质过程。病死猪堆肥相对于传统的死猪处理方法，如，掩埋、焚烧、高温熬煮等，具有更加安全和环保的优势。堆肥过程的物质转化归根到底是由堆肥体系中微生物的代谢活动来完成。因此充分了解病死猪堆肥体系中微生物的菌群种类和动态分布，挖掘病死猪堆肥体系的优势微生物，为开发病死猪堆肥微生物菌剂，促进腐熟进程，缩短堆肥周期奠定基础。　　本研究通过开展6个月为一个堆肥周期的病死猪尸体自然发酵试验，检测了堆肥过程不同阶段的理化参数，利用PCR-DGGE技术分析了堆肥过程不同阶段的微生物种类，构建了系统树。分离和筛选出5株高温优势菌，并通过生理生化实验和16s rRNA测序对这5株优势菌进行了初步鉴定。主要研究结果如下:　　(1)实时监测病死猪堆肥不同阶段不同高度的温度变化，对不同阶段的样品含氮量、含水率、pH值、有机质含量、有效活菌数、蛔虫死亡率、重金属含量和类大肠杆菌数理化参数进行测定和分析。堆肥试验中堆体温度的变化经历了典型的升温期、高温期、降温期三个阶段，且堆体上、中、下三层温度的变化趋势基本是一致的，前3个月是有机质降解阶段，微生物活动频繁，中层温度近70℃;pH变化遵循先下降-再升高-再下降的进程趋势。堆肥结束，病死猪尸体软组织全部降解，堆料腐熟，外观成黑色颗粒如腐殖质，依稀可见骨头和牙齿，但这些难降解物质很脆，容易捏碎。氮含量为5.3％左右，有机质含量为53％，大肠杆菌值低于100个/g，蛔虫卵杀灭率接近于100％，有效活菌数接近于0.35亿/g，堆体周围没有活的蛆、蛹或新羽化的成蝇，达到了《粪便无害化卫生标准(GB7959-87)》的规定。　　(2)提取了微生物基因组总DNA，完成了16s rRNA V6～V8区片段的PCR扩增。通过变形梯度凝胶电泳，得到了18个样品的DGGE图谱。通过QuantityOne软件分析DGGE图谱发现，各个时期的细菌丰富度都比较高。前三个月的细菌的分布比较凌乱，后三个月的细菌分布趋于稳定。致病菌只在前三个月存在，后三个月致病菌被杀死。分别对切胶回收后的45条优势条带测序，并与已知序列在NCBI上进行同源性比对，得到了这45条序列的详细结果并完成了它们的系统发育分析。结果发现，堆肥过程中存在大量未知细菌，它们在堆肥过程中的作用还有待探究。堆肥过程的优势菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）、枝芽孢杆菌（Virgibacillus）和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。　　(3)传统培养并结合高温处理，分离获得了5株优势菌。通过生理生化鉴定、显微镜形态观察和16s rRNA测序，结果显示，J1为未知菌与已知的Unculturedbacterium clone(JF155193)相似率为98％，J2、J3和J5为Bacillus subtillis strain，J4为Bacillus thuringiensis strain。产淀粉酶酶活性由强至弱依次为J4，J1，J2，J3，J5，产蛋白酶活性由强至弱依次为J1， J5， J2， J4， J3，产脂肪酶活性由强至弱依次为J3，J2，J5，其中J1和J4不产生脂肪酶。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 国内畜禽尸体处理现状

1．2 病死畜禽无害化处理方法

1．2．1 焚烧法

1．2．2 深埋法

1．2．3 化制法

1．2．4 堆肥法

1．3 病死猪好氧发酵堆肥技术

1．3．1 病死猪堆肥发酵原理

1．3．2 病死猪堆肥方式

1．3．3 病死猪堆肥的理化性质

1．4 生物有机肥

1．5 微生物生态学的研究方法

1．5．1 传统培养微生物分析方法

1．5．2 生物标记微生物分析方法

1．5．3 现代微生物分析方法

第二章 研究的目的与意义

第三章 材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 用于DGGE分析的DNA样品

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 主要试剂、药品及试剂盒

3．1．4 主要化学试剂及其配制

3．2 实验方法

3．2．1 样品采集和堆肥样品表观特征分析

3．2．2 堆肥过程中理化参数的测定

3．2．3 堆肥样品基因组DNA的提取、纯化

3．2．4 PCR

3．2．5 变性梯度凝胶电泳

3．2．6 堆肥样品优势菌的分离、筛选及鉴定

第四章 结果与分析

4．1 堆肥样品表观特征分析

4．2 堆肥化过程中的理化参数变化

4．3 PCR-DGGE

4．3．1 堆肥样品微生物总DNA的提取和质量检测

4．3．2 细菌近全长16S rRNA片断的扩增

4．3．3 堆肥样品的16S rRNA特异性扩增

4．3．4 DGGE图谱及系统进化分析

4．3．5 堆肥样品细菌的系统进化分析

4．4 堆肥样品优势菌的分离、筛选及鉴定

4．4．1 堆肥样品优势菌的分离与纯化

4．4．2 堆肥样品优势菌的形态观察

4．4．3 堆肥样品优势菌的生理生化鉴定

4．4．4 5株优势菌的淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶活性检测

4．4．5 5株优势菌的16s rRNA测序分析

第五章 分析与讨论

5．1 病死猪尸体堆肥过程中的理化性质

5．2 PCR-DGGE技术

5．3 微生物多样性分析

5．4 可培养的优势菌的分离及鉴定

第六章 小结

6．1 本研究目前取得的研究结果

6．2 下一步值得研究的工作

参考文献

致谢