湖北省水稻白叶枯菌的小种组成及定量检测体系的建立

摘要

水稻白叶枯病曾经是我国水稻生产上的“三大病害”之一，后由于抗病品种的推广应用，病害发生危害得到一定程度的控制。目前，本病在我国不同水稻种植区，尤其是沿海稻区仍是影响水稻生产的重要障碍因素。监测和掌握发病地区白叶枯菌小种毒力分化、群体结构及遗传变异等，可以对抗病品种的选育与合理利用作出指引，是控制病害发生、降低产量损失的有效途径。　　本研究对从湖北省水稻主产区采集到的白叶枯病标样，并分离得到的71个白叶枯菌株进行了小种鉴定和遗传多样性分析。在此基础上，初步建立了针对白叶枯菌的实时荧光定量PCR检测体系，对其特异性和灵敏度进行了检测，并应用该体系对接种白叶枯菌后水稻叶片Xoo菌量变化进行了追踪测定，取得的主要结果如下。　　1.对2013-2014年间于湖北省各地区采集分离得到的71个水稻白叶枯菌株利用鉴别寄主法进行了小种鉴定，结果表明有R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9这7个小种。其中优势小种为R3（出现频率为33.80％）。与前期小种鉴定结果相比，2007-2009年到2013-2014年，湖北省优势小种从R4变为R3，各市优势小种变化较大，武汉市的优势小种仍为R4，但频率增加了28.0％;孝感市的优势小种由R4、R5、R9变为R3、R5;宜昌市的优势小种由R4、R5变为R1;黄冈市的优势小种由R3、R4变为R3;荆州市的优势小种由R5变为R4;咸宁市的优势小种由R3、R5变为R3;襄阳市的优势小种由R2、R4变为R1。　　2.对71个菌株基因组DNA进行Rep-PCR扩增，将得到的指纹带型进行聚类分析结果表明:引物ERIC、BOX分别呈现出16、15种谱型，引物REP的分辨率太低，不能进行聚类分析。以彼此带位相似率70％为界，通过UPGMA聚类分析可将71个菌株分别引物ERIC、BOX扩增谱型分别分为13簇、8簇。然而本次试验未发现菌株的地理来源、小种和遗传多样性之间有显著相关性。　　3.试验还筛选出了高特异性、高灵敏度的引物，建立了对水稻白叶枯菌实时荧光定量检测体系。在同普通PCR检测作对比的试验中，对菌液、模拟带菌种子、模拟带菌土壤的检测结果表明，实时荧光定量PCR比普通PCR的灵敏度要高10-1000倍，最低可以检测出浓度为100个拷贝/μL的标准品质粒、103cfu/mL的菌液。在模拟带菌种子和土壤检测中，均可以检测到病菌，但实时荧光定量PCR检测灵敏度仍比常规PCR要高。试验还制作了标准品质粒，用来进行精确的定量试验，对人工接种后水稻叶片上Xoo菌量变化进行了检测，找到了水稻显症的阈值为10cm长度叶片上Xoo菌量在108个左右，为病害的预警提供支持。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 水稻白叶枯病发现历史和危害

2 对Xoo致病型分化的研究进展

3 Xoo遗传多样性研究进展

3．1 分析Xoo遗传多样性的RFLP技术

3．2 分析Xoo遗传多样性的PCR技术

4 Xoo的检测方法

5 研究目的

第二章 湖北省水稻白叶枯菌的小种组成

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 白叶枯病标样采集和菌株分离结果

2．2 小种鉴定结果

2．3 湖北省近年白叶枯菌小种组成变化

3 讨论

第三章 湖北水稻白叶枯菌遗传多样性分析

1 材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 REP-PCR扩增结果

2．2 UPGMA聚类分析结果

3 讨论

第四章 水稻白叶枯菌定量检测体系的建立

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 普通PCR验证引物特异性结果

2．2 Real-Time PCR检测引物特异性结果

2．3 引物灵敏度的检测

2．4 模拟水稻白叶枯菌侵染检测结果

3 讨论

参考文献

附录

致谢