防治哈密瓜细菌性果斑病拮抗酵母菌的筛选及其生防机理研究

摘要

由燕麦嗜酸菌西瓜亚种（Acidovorax avertae subsp．citrulli，Aac）引起的哈密瓜果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）是瓜类生产中一种毁灭性细菌性病害。目前在瓜类作物中无免疫品种。虽然化学防治对该病有一定的防治效果，但是大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、农药残留，以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治被认为是一种合理而又安全的防治手段。探讨利用酵母菌防治哈密瓜细菌性果斑病是非常必要的。本论文从拮抗酵母菌的筛选、防效评估、拮抗酵母菌菌株的鉴定、发酵体系、抑菌物质的理化性质、以及抑菌机理等方面进行了系统研究，获得如下研究结果：　　 1、从湖北武汉、河南信阳和新疆石河子采集的植物和土壤等样品中分离获得463株酵母菌。经过平板抗生性测定和盆栽活体试验，成功筛选出一株有效防治哈密瓜细菌性果斑病的拮抗酵母菌菌株0732-1。　　 2、在温室试验中，用酵母菌0732-1发酵液处理带菌哈密瓜种子，能显著降低Aac对哈密瓜幼苗的侵染。在第一次试验中，使用0732-1、农用链霉素和盐酸处理带菌种子的发病率分别为2.8％、0和2.6％，对照发病率为97.6％。在第二次试验中，发病率分别是7％、8.8％和3.7％，对照发病率为83.3％。两次试验中防病效果三者间无显著差异（P>0.05）。在田间试验中，酵母菌0732-1发酵液（1×107cfu/ml或1x109cfu/ml）能有效降低哈密瓜细菌性果斑病的危害。另外，酵母菌0732-1先于Aac接种的防效优于同时接种酵母菌和Aac的防效。在哈密瓜幼苗灌根施用中，酵母菌0732-1无显著防病和促生的效果。　　 3、根据形态特征、营养代谢特征、生理生化特性、以及ITS-5.8S rDNA片段序列分析（GenBank数据库中登录号为HU380207），将酵母菌0732-1鉴定为Pichiaanomala。　　 4、酵母菌0732-1能利用8种碳源（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、柠檬酸钠、乳糖、甘油和乙醇）和6种氮源（硫酸铵、硝酸铵、尿素、磷酸二氢铵、硝酸钾、蛋白胨）进行生长和繁殖，并能产生抑制Aac的抗细菌物质（antibacterial substances，ABS）。其中6种碳源（果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乙醇和甘油）和4种氮源（硫酸铵、磷酸二氢铵、硝酸钾和蛋白胨）适于产生ABS。最适碳源为果糖。磷酸二氢钾（29.39 mmol/L）有利于酵母菌0732-1产生ABS。　　 5、酵母菌0732-1抑菌谱广，对供试17种真菌和4种细菌具有抑制效果，其中6种真菌和1种细菌（Aac）是侵染瓜类植物的病原菌。因而，此酵母菌具有防治多种瓜类植物病害的潜质。　　 6、通过单因素试验对酵母菌0732-1产生ABS的条件进行了研究。试验结果表明：酵母菌0732-1产生ABS的最适环境条件是：初始pH值为9.0；装样量为80ml（250ml三角瓶）；接种量为10％；温度20℃；培养96 h后，发酵液中的ABS抑菌活性达到最大。　　 7、酵母菌0732-1产生的ABS可能是一类耐热、耐酸、抗紫外线的非蛋白极性物质。当环境pH高于9.0时，抑菌活性完全丧失。采用硫酸铵分级沉淀和有机溶剂萃取不能从发酵液中分离出ABS。利用蒸馏法可以得到部分ABS。　　 8、试验证实：酵母菌0732-1的防病机制包括抗生作用和诱导寄主抗性。酵母菌0732-1在培养过程中能产生大量的ABS，并能对Aac具有明显抑菌作用；施用该菌及其发酵物均能提高哈密瓜幼苗体内3种防卫反应相关酶（POD、PAL和CAT）的产生。同时还发现酵母菌0732-1在大田条件下，能迅速定殖于哈密瓜叶片和果实表面上。在瓜叶上接种15 d后，种群为1.2×105cfu/c㎡：在哈密瓜幼果上接种10 d后，种群数量为1×107cfu/c㎡。虽有下降，但趋势波动不大。　　 上述研究结果为进一步开发利用酵母菌0732-1防治哈密瓜细菌性果斑病奠定了基础。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表(Abbreviation)

声明

第一章文献综述

1.哈密瓜细菌性果斑病简介及防治研究现状

2.生防酵母菌在植物病害中研究与应用现状

3.拮抗酵母菌抑菌机理研究

4.生防酵母菌在商业化应用中存在的问题及未来发展前景

5.研究的目的和意义

第二章拮抗酵母菌的分离与筛选

1材料和方法

1.1供试培养基

1.2供试病原菌

1.3供试植物

1.4酵母菌的分离、纯化及保存

1.5拮抗酵母菌的筛选

1.6数据分析与统计

2结果与分析

2.1酵母菌的分离

2.2平板筛选

2.3活体植株筛选

3结论与讨论

第三章酵母菌0732-1生防效果评估

1材料与方法

1.1试验材料

1.2试验方法

1.3数据分析与统计

2结果与分析

2.1带菌种子处理试验

2.2酵母菌0732－1发酵液对Aac的致死效应

2.3田间促生防病效果

2.4田间接种浓度对哈密瓜叶片防病效果的影响

2.5田间间隔接种时间对哈密瓜叶片防病效果的影响

2.6室内接种浓度对哈密瓜果实防病效果的影响

2.7田间接种浓度对哈密瓜果实防病效果的影响

3结论与讨论

第四章 酵母菌0732-1的鉴定

1材料与方法

1.1供试培养基

1.2供试试剂

1.2酵母菌0732-1的鉴定

1.3生理生化特性测定

1.4耐盐性测定

1.5 ITS-5.8S rDNA序列分析

1.6数据分析与统计

2结果与分析

2.1形态特征

2.2生理生化特征

2.3耐盐性测定

2.4 ITS-5.8S rDNA序列分析

3结论与讨论

第五章酵母菌0732-1产生抗细菌物质的规律研究

1材料及方法

1.1培养基及供试菌株

1.2供试菌株培养

1.3抗细菌生物活性测定

1.4酵母菌0732-1生长曲线的测定

1.5碳源对酵母菌0732-1产生ABS的影响

1.6氮源对酵母菌0732-1产生ABS的影响

1.7培养基类型对酵母菌0732-1产生ABS的影响

1.8 KH2PO4对酵母菌0732-1产ABS的影响

1.9培养条件对酵母菌0732-1生长和产生ABS的影响

1.9数据分析与统计

2结果与分析

2.1酵母菌0732-1生长曲线的测定

2.2碳源对酵母菌0732-1产生ABS的影响

2.3氮源对酵母菌0732-1产生ABS的影响

2.4培养基类型对酵母菌0732-1产生ABS的影响

2.5 KH2PO4对酵母菌0732-1产生ABS的影响

2.6培养条件对酵母菌0732-1产生ABS的影响

3结论与讨论

第六章酵母菌0732-1产生的ABS特性研究

1材料及方法

1.1试验材料

1.2抗细菌物质粗提液的制备

1.3.ABS粗提液生物活性测定

1.4酵母菌0732-1抑菌谱测定

1.5有关酵母菌0732-1ABS粗提液的几个属性

1.6酵母菌0732-1产生的ABS的初步提取

1.7数据分析与统计

2结果与分析

2.1酵母菌0732-1的抑菌谱

2.2有关酵母菌0732-1ABS粗提液的几个属性

2.3酵母菌0732-1ABS的初步提取

3结论与讨论

第七章 酵母菌0732-1生防机理初探

1材料与方法

1.1试验材料

1.2酵母菌0732-1发酵液抑制Aac活性测定

1.3酵母菌0732-1田间定殖动态

1.4酵母菌0732-1对哈密瓜防御反应相关酶的诱导作用

1.5数据分析与统计

2结果与分析

2.1酵母菌0732-1平板抗细菌活性测试

2.2酵母菌0732-1在哈密瓜植株上种群动态变化

2.3酵母菌0732-1对哈密瓜防御反应相关酶的诱导作用

3结论与讨论

第八章结论、创新与展望

1结论

2创新

3展望

参考文献

致谢

附录