TOPK磷酸化ULK1抑制自噬促进胶质瘤对TMZ耐药及机制研究

目录

声明

中英文缩略词对照表

引 言

1 实验材料与试剂

1.1实验材料

1.2 主要试剂及材料

1.3 主要溶液配制

1.4 实验主要仪器和设备

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 质粒提取

2.3 慢病毒介导的TOPK沉默稳定细胞系的建立

2.4 TOPK过表达稳定细胞系的建立

2.5 Western Blot

2.6 细胞活性实验

2.7 透射电镜观察自噬体

2.8 荧光方法观察自噬体

2.9 pET23a-ULK1-FL/KD/SPR/CTD-His的构建

2.10 原核表达及蛋白纯化

2.11 pcDNA4-His-ULK1-FL/KD/SPR/CTD的构建

2.12 真核表达及蛋白纯化

2.13 Pull down实验

2.14 体外激酶实验

2.15 质谱分析

2.16 ULK1突变质粒的构建及稳定细胞系的建立

2.17 免疫共沉淀

2.18 锚定非依赖生长实验

2.19 统计学分析

3 实验结果

3.1 在胶质瘤细胞中TOPK抑制自噬起始

3.1.1 在胶质瘤细胞中TOPK抑制LC3-Ⅱ的表达，促进P62的表达，抑制自噬

3.1.2 在胶质瘤细胞中TOPK抑制自噬起始

3.2 TOPK在Ser469，Ser495和Ser533三个位点磷酸化ULK1，抑制其活性和降低其稳定性，抑制自噬

3.2.1 TOPK与ULK1直接结合并在Ser469、Ser495和Ser533三个位点磷酸化ULK1

3.2.2 在胶质瘤细胞中 TOPK 磷酸化抑制 ULK1 的活性及降低其稳定性

3.2.3 TOPK在Ser469，Ser495和Ser533三个位点磷酸化ULK1，抑制其活性及降低其稳定性

3.2.4 TOPK在Ser469、Ser495和Ser533三个位点磷酸化ULK1抑制自噬起始

3.3 TOPK在Ser469，Ser495和Ser533三个位点磷酸化ULK1，抑制自噬，促进胶质瘤对TMZ耐药

3.3.1 抑制TOPK，诱导自噬起始，增强胶质瘤细胞对TMZ的敏感性

3.3.2 ULK1的Ser469、Ser495和Ser533三个位点的突变诱导自噬起始，增强胶质瘤细胞对TMZ的敏感性

讨论

结论

参考文献

综述:ULK1的研究进展

致谢

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