粉尘螨1类变应原T和B细胞表位嵌合基因的构建、表达及特异性免疫治疗研究

摘要

目的：构建编码粉尘螨1类变应原(Der f1)B的细胞表位与T细胞表位嵌合基因原核表达载体，并进行大规模表达纯化，以及探究重组变应原的特异性免疫治疗(Allergen Specific Immunotherapy,ASIT)效果。
　　方法：⑴将Der f1所包含的5个T细胞表位(T1～T5)与6个B细胞表位(B1～B6)，按照B1-T1-B2-T2-B3-T3-B4-T4-B5-T5-B6和B1-B2-B3-B4-B5-B6-T1-T2-T3-T4-T5连接方式，直接合成表位嵌合基因，并分别命名为Der f1A和Der f1B。构建原核表达重组质粒pET-28a(+)-Der f1A和pET-28a(+)-Der f1B，通过经限制性内切酶BamH I/Xho I进行双酶切鉴定，并在测序验证的阳性后，克隆转化到E coli BL21(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE分析各表达的产物并纯化，同时利用Western bloting进行鉴定验证。ELISA检测法检测各表达的嵌合蛋白对粉尘螨过敏患者的血清IgE抗体的结合力。⑵动物实验:把50只小鼠随机分为:A组:阴性对照组、B组:哮喘组、C组:Derf1治疗组、D组:重组融合变应原Derf1B治疗组、E组:重组融合变应原Der f1A治疗组等5组。其中哮喘组、Der f1治疗组、Der f1B治疗组和Der f1A治疗组小鼠用粉尘螨提取液于第1、7、14d进行3次腹腔注射致敏，并于第21 d开始行雾化吸入激发，持续7d。其中治疗组于雾化吸入前30分钟，分别用Der f1、Derf1B、Der f1 A进行特异性免疫治疗。对照组用磷酸盐缓冲液(PBS)进行腹腔注射及雾化吸入。完成雾化吸入激发实验后，分别进行；计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数；观察肺组织病理切片;3检测BALF与脾细胞培养上清液(SSCS)中IL-5、IFN-γ;4血清中特异性IgE、IgG2a水平。
　　结果：双酶切及测序的结果表明，成功构建了原核表达重组质粒pET-28a(+)-Der f1A与pET-28a(+)-Der f1B;SDS-PAGE分析表明，Der f1A与Der f1B成功诱导，并纯化成功。Western blotting的结果进一步证实纯化了Der f1A和Derf1B的嵌合蛋白。同时进行了大规模的纯化。与Der f1相比，发现Der f1A与Der f1B嵌合蛋白和粉尘螨过敏患者的血清IgE抗体的结合能力显著降低(P＜0.01)，但是Der f1A与Derf1B之间差异无统计学意义(P＞0.05)。用Der f1A和Der f1B嵌合蛋白分别对粉尘螨粗提取液致敏的小鼠哮喘模型进行特异性免疫治疗后，经ELISA法检测，结果表明:Derf1组、Der f1A和Der f1B组小鼠的肺部炎症比哮喘组明显减轻。Der f1组、Der f1A与Der f1B组小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数均明显降低，但Der f1组与Der f1A组、Der f1B组相比，没有明显的差异(P＞0.05)。 ELISA法检测的各组小鼠SSCS与BALF中的IFN-γ与IL-5水平，结果显示:Derf1组、Der f1A组、Derf1B组和哮喘组比较，SSCS和BALF中IFN-γ含量则显著升高(P＜0.01)，IL-5的水平明显降低(P＜0.01)，Der f1组、Der f1A组、 Der f1B组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。Der f1组、Der f1A组、 Der f1B组血清中变应原特异性IgE抗体的浓度降低显著(P＜0.01)，Der f1组、Der f1A组、 Derf1B组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。IgG2a浓度则显著升高(P＜0.01)，Der f1组、Der f1A组、 Der f1B组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：成功表达了Derf1的B和T细胞的表位嵌合蛋白，同时进行了大规模纯化;所表达的嵌合蛋白成功通过对尘螨过敏性哮喘模型的小鼠进行治疗，且在一定程度上可有效减轻哮喘模型的小鼠的肺部炎症。粉尘螨1类变应原的小分子低毒过敏原构建成功，为诊断和治疗过敏性哮喘奠定基础。

目录

声明

摘要

注释说明清单

引言

第一部分 粉尘螨1类变应原T与B细胞表位嵌合基因的构建与表达

1 研究内容

1．1 基因合成

1．2 设计引物

2 材料与方法

2．1 主要试剂

2．2 主要试剂配置

3 实验方法

3．1 重组表达质粒的构建

3．2 重组质粒的提取

3．3 重组质粒的双酶切鉴定

3．4 E．coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化

3．5 菌落PCR、筛选阳性菌及测序

3．6 Der f1，Der f1A，Der f1B蛋白的小量诱导表达

3．7 Der f1，Der f1A，Der f1B蛋白的SDS-PAGE分析

3．8 Der f1，Der f1A，Der f1B蛋白的大量诱导表达

3．9 Der f1，Der f1A，Der f1B蛋白的纯化及鉴定

3．10 纯化产物的免疫印记(western blot)分析

3．11 Bradford’s法定量蛋白浓度

4 结果

4．1 重组融合表位基因Der f1A、Der f1B的PCR扩增

4．2 重组质粒鉴定

4．3 Der f1，Dcr f1A，Der f1B蛋白的SDS-PAGE分析

4．4 Der f1，Der f1A，Der f1B重组蛋白的纯化

4．5 纯化产物的免疫印迹(Western blot)鉴定

4．6 重组蛋白的浓度测定

4．7 Der f1B与Der f1A对粉尘螨过敏患者的血清IgE结合力

讨论

第二部分 Der f1A、Der f1B嵌合蛋白对哮喘小鼠免疫治疗的效果分析

1 研究内容

2 材料与方法

2．1 材料与试剂

2．2 实验材料

2．3 主要试剂

2．4 主要试剂配制

3 实验步骤

3．1 实验动物分组

3．2 建立哮喘小鼠模型

3．3 特异性免疫治疗

3．4 实验标本取材及指标检测

3．5 统计学方法

4 结果

4．1 各组小鼠症状与体征的改变

4．2 ELISA法测定血清中特异性IgE和IgG2a的含量

4．3 ELISA法测定小鼠脾细胞培养上清液中抗原特异性IL-5和IFN-γ的含量

4．4 肺组织切片HE染色

4．5 ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中特异性细胞因子IL-5和IFN-γ的含量

4．6 BALF中细胞分类计数

5 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介及读研期间主要科研成果