表达cdk5-siRNA重组腺相关病毒载体的构建及CDK在NPC神经变性中的作用

摘要

第一部分 不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察 目的 了解npc小鼠不同年龄阶段cdk活化所导致的神经元细胞骨架损害的程度。以便进一步探索NPC的发病机制和新的治疗策略。 方法 在小鼠出生后的1、2、3、4和5周处死所有同龄的小鼠，然后采用PCR的方法鉴定基因型，保留npc-/-小鼠和相应数量的同龄野生型小鼠(每年龄组至少4只)的脑组织做免疫组织化学染色，观察cdk活化所致的球状神经轴突出现的时间和数目。 结果 在3周npc小脑即可检测到cdk的异常活化所引起的球状神经轴突，且在小脑较脑干出现早、数量更多。球状神经轴突数目随着小鼠的年龄增大越来越多。 结论 ①npc小鼠自3周龄开始出现神经元细胞骨架损害及cdk激活；②病变的严重程度随年龄增长而增加。 第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定 目的 构建能表达cdk5特异性siRNA(cdk5-siRNA)的Ⅱ型重组腺相关病毒载体，体外观察其对cdk5基因的特异性沉默作用。 方法 设计一段在体内能转录出特异性cdk5-siRNA的寡核苷酸序列，人工合成该序列后采用基因克隆技术，将其克隆至通用RNAi表达质粒pSilencer-U6中，构建出质粒pSilencer-U6-cdk5-siRNA。同时将EGFP连入表达质粒pAAV-MCS，得到质粒pAAV-MCS-EGFP。然后通过PCR从pSilencer-U6-cdk5-siRNA中扩增出U6-cdk5-siRNA片段，并将其克隆至pAAV-MCS-EGFP，构建出表达质粒pAAV-MCS-EGFP-cdk5-siRNA-U6。重组质粒通过酶切，测序鉴定后与该系统中的控制质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞，包装得到表达cdk5-siRNA的Ⅱ型重组腺相关病毒载体(rAAV2-cdk5-siRNA)。重组病毒纯化后通过斑点杂交法测定滴度，病毒感染体外培养的PC12细胞，Westernblot检测其抑制cdk5表达的特异性和效果。 结果 各质粒构建正确，成功包装出重组腺相关病毒载体rAAV2-cdk5-siRNA，病毒滴度达2×1012v.g/ml，重组病毒能感染体外培养的PC12细胞，并能明显而特异性下调cdk5的表达。 结论 构建的重组腺相关病毒载体rAAV2-cdk5-siRNA能明显干扰细胞内cdk5的表达，为进一步探索cdk在神经变性过程中的地位和神经变性疾病基因治疗的可行性奠定了基础。

目录

论文说明：缩略词一览表

前言

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察摘要

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察英文摘要

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察前言

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察材料和方法

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察结果

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察讨论

第一部分不同年龄阶段npc小鼠神经元细胞骨架损害的动态观察参考文献

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定中文摘要

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定英文摘要

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定前言

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定材料

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定方法

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定结果

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定讨论

第二部分利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定参考文献

研究内容小结

综述NPC神经变性机制研究进展

致谢