CRISPR/xCas9 3.7的结构与功能机制研究

目录

第1 章 绪 论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 基因编辑技术的发展历程

1.2.1 锌指核酸酶技术

1.2.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术

1.2.3 CRISPR/Cas 系统的发展

1.3 CRISPR/Cas 系统

1.3.1 CRISPR/Cas 系统的结构组成

1.3.2 CRISPR/Cas 系统的分类

1.3.3 CRISPR/Cas 系统的作用机制

1.4 CRISPR/Cas 系统的应用及面临的挑战

1.4.1 CRISPR/Cas 系统的应用

1.4.2 PAM 序列的限制性

1.4.3 脱靶效应

1.5 本文主要研究内容及技术路线

1.5.1 本文主要研究内容

1.5.2 技术路线

第2 章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 质粒和细胞

2.1.2 化学试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 常用试剂的配置

2.2 实验方法

2.2.1 分子克隆

2.2.2 蛋白质的表达与纯化

2.2.3 RNA 的体外转录与纯化

2.2.4 蛋白质晶体的筛选与结构解析

2.2.5 体外酶切实验与定量分析

2.2.6 电泳迁移率实验

2.2.7 细胞的培养与转染

2.2.8 T7E1 实验

第3 章 xCas9 3.7-sgRNA-dsDNA 复合物的表达纯化

3.1 引言

3.2 xCas9 3.7 蛋白的克隆与表达

3.3 xCas9 3.7 蛋白的纯化

3.4 sgRNA 的体外转录与纯化

3.5 xCas9 3.7-sgRNA-dsDNA 复合物的组装

3.5.1 xCas9 3.7/AAG 复合物的组装

3.5.2 xCas9 3.7/AGA 复合物的组装

3.5.3 xCas9 3.7/GAT 复合物的组装

3.5.4 xCas9 3.7/CAT 复合物的组装

3.6 本章小结

第4 章 xCas9 3.7-sgRNA-dsDNA 复合物的结晶与数据处理

4.1 引言

4.2 复合物结晶的初步筛选

4.3 复合物晶体条件的优化

4.4 防冻液的选择

4.5 晶体的数据收集及结构解析

4.6 本章小结

第5 章 xCas9 3.7-sgRNA-dsDNA 复合物的三维结构

5.1引言

5.2 xCas9 3.7-sgRNA-dsDNA 复合物的整体结构

5.3 xCas9 3.7 与 SpCas9 复合物整体结构的比较

5.4 xCas9 3.7 具有 PAM 兼容性的结构基础

5.5 xCas9 3.7 的 REC2 和 REC3 结构域的构象变化

5.6 本章小结

第6 章 xCas9 3.7-sgRNA-dsDNA 复合物功能机制的研究

6.1 引言

6.2 xCas9 3.7 具有识别 PAM 的兼容性的机制研究

6.3 xCas9 3.7 具有高保真性的机制研究

6.4 新型 SpCas9 变异体在体外保真性的检测

6.5 新型 SpCas9 变异体在 293T 细胞内的保真性检测

6.6 本章小结

结 论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致 谢

个人简历