咪达唑仑对氯胺酮致胎鼠神经细胞自噬和凋亡保护作用的研究

摘要

麻醉是动物临床诊疗中的关键环节，然而麻醉也具有一定的副作用，如引起的神经变性，现在已引起广泛关注。氯胺酮是临床常用的静脉麻醉剂之一，由于其具有良好的镇痛作用而备受青睐，但同时它的神经毒性作用也是不容忽视的。据报道，包括咪达唑仑在内的一些麻醉药可起到保护神经元的作用，但咪达唑仑的神经保护作用机制尚不清楚。且对于咪达唑仑是否能减轻氯胺酮引起的损害，也尚不清楚。因此，为了解对孕鼠进行氯胺酮麻醉时，对胚胎造成的影响，本实验通过氯胺酮来麻醉孕鼠，以胎鼠为实验对象，研究氯胺酮对胎鼠脑神经元的影响，以及咪达唑仑在氯胺酮麻醉时是否能够起到保护作用。为今后寻找相对安全的麻醉方式提供理论依据。还可以为怀孕动物麻醉提供一些理论支持，尽量避免麻醉对幼子造成过多的伤害。　　将怀孕大鼠随机分为4组，在怀孕第19天时，对照组（C组）大鼠不进行任何处理，氯胺酮组（K组）大鼠肌注氯胺酮，咪达唑仑组（M组）大鼠肌注咪达唑仑，咪达唑仑+氯胺酮组（K+M组）大鼠同时肌注氯胺酮和咪达唑仑，进行剖腹产，取出胎鼠。采用Western-blot的方法检测自噬与凋亡的相关蛋白变化，如微管相关蛋白1轻链3(autophagy marker light chain3，LC3)、自噬相关基因4(autophagy-related gene4，ATG4)、ATG5、Bcl-2同源结构域蛋白（Beclin-1）、切割的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved-caspase-3，c-caspase-3）、自噬底物P62蛋白(P62)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bcl-2 associated X protein，Bax)的蛋白变化;用氧化应激相关试剂盒来检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)。应用CCK-8试剂盒检测出氯胺酮、咪达唑仑和过氧化氢对PC12神经细胞的最佳药物作用浓度，随后建立氧化应激的细胞模型，以及加入自噬促进剂(Rapa)和抑制剂(3-MA)来进行离体验证。应用mRFP-EGFP-LC3双荧光自噬指示体系进行检测，用来研究对LC3的追踪以及自噬流的变化。再采用流式细胞术技术来检测氯胺酮对PC12细胞造成的凋亡影响，以及咪达唑仑在其中起到的作用。再通过Western-blot的方法测定自噬与凋亡相关蛋白的变化来再次验证得到的在体结果。　　结果发现:　　1.氯胺酮通过增加c-caspase-3和Bax的表达，并降低Bcl-2的表达来诱导胎鼠海马和PC12细胞发生细胞凋亡。　　2.氯胺酮也增加LC3II、Beclin-1和ATG5蛋白的表达，降低ATG4和P62的表达，最终诱导胎鼠海马和PC12细胞发生自噬。　　3.氯胺酮促进ROS和MDA的产生，降低T-AOC。　　4.K+M组与K组相比，自噬与凋亡相关蛋白有显著差异性(P＜0.05)。　　5.M组与C组相比，自噬与凋亡相关蛋白没有明显变化。　　结果表明氯胺酮麻醉导致胎鼠海马发生自噬和细胞凋亡。氯胺酮还通过ROS的产生来诱导凋亡途径和自噬的激活，从而在神经元中诱导毒性。咪达唑仑通过降低ROS的产生来改善氯胺酮对神经细胞的毒性作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 麻醉概述

1．1．1 氯胺酮

1．1．2 咪达唑仑

1．2 孕期麻醉

1．2．1 概述

1．2．2 大脑的发育特点

1．2．3 孕期使用氯胺酮对胚胎的影响

1．3 自噬

1．3．1 自噬概述

1．3．2 自噬的分类和形成过程

1．3．3 自噬的生理／病理作用

1．3．4 麻醉与神经细胞自噬

1．4 细胞凋亡

1．4．1 细胞凋亡概述

1．4．2 神经系统的细胞凋亡

1．4．3 麻醉与神经细胞凋亡

1．5 氧化应激

1．5．1 氧化应激概述

1．5．2 ROS的来源

1．5．3 麻醉与ROS

1．6 实验目的与意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验仪器及试剂

2．1．2 实验动物

2．2 实验方法

2．2．1 怀孕时间的确定

2．2．2 药物管理和样品收集

2．2．3 细胞培养和处理

2．2．7 Annexin V-FITC／PI试剂盒检测

2．2．8 ROS的测定

2．2．10 Western-blot测定蛋白

2．3 数据统计分析

3 结果

3．3 咪达唑仑减弱氯胺酮对胎鼠海马的影响

3．4 氯胺酮和咪达唑仑和过氧化氢对PC12细胞的最佳药物作用浓度的确定

3．5 氯胺酮和咪达唑仑对PC12细胞的自噬和凋亡的影响

3．6 H2O2对PC12细胞的自噬和凋亡的影响

4 讨论

4．1 孕鼠氯胺酮麻醉对胎鼠神经元自噬的影响

4．2 孕鼠氯胺酮麻醉对胎鼠神经元凋亡的影响

4．3 孕鼠氯胺酮麻醉对胎鼠ROS的影响

4．4 咪达唑仑能够减轻孕鼠氯胺酮麻醉对胎鼠神经细胞的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文