细胞色素P450氧化还原酶基因多态性与肝癌易感性

摘要

目的：　　肝癌通常指肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是全球第三大癌症相关死亡原因。HCC发生的主要原因包括肝炎病毒感染、化学致癌物、酒精以及肥胖相关代谢异常，这些因素可能引起慢性炎症和免疫抑制，最终导致HCC的发生。此外，基因多态性作为一种内在因素，可能通过影响个体的HCC易感性从而介导HCC的发生。因此，将HCC发生的主要机制归纳为炎症（inflammation）、代谢（metabolism）、免疫（immune）和基因多态性（polymorphism）等4个方面。　　细胞色素P450氧化还原酶（cytochrome P450oxidoreductase，POR）是肝微粒体细胞色素P450酶（cytochrome P450enzymes，CYPs）的唯一电子供体，具有高度多态性。文献报道不同的POR单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点的基因变异能够影响不同CYPs活性，可能因此具有疾病易感性，如POR基因多态性与乳腺癌和膀胱癌易感性有关，可能是由于影响了类固醇代谢相关CYPs活性。　　本研究选取105例正常肝组织样本和102例HCC患者癌旁组织样本，考察POR基因多态性与HCC易感性的关系，并采用Label-free定量蛋白质组学方法探究POR易感性位点影响HCC发生的可能机制。本课题以期发现新的HCC易感性位点，并为POR基因多态性和HCC发生机制研究提供新策略和依据。　　方法：　　1.人肝标本及临床资料收集　　收集105例正常肝组织标本和102例HCC患者癌旁肝组织标本，并纳入每个供体的性别、年龄、烟酒史和临床诊断等基本信息，以及丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）、总蛋白（total protein，TP）和球蛋白（globulin，GLO）等临床指标。对于纳入研究的HCC患者，自切除术后进行随访，历时42~54个月。本研究的实验方案经过郑州大学伦理委员会批准，受试者均已签署知情同意书。　　2.人肝微粒体制备　　采用差速离心法制备人肝微粒体。　　3.肝微粒体蛋白浓度测定　　采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。　　4.CYP2E1活性测定　　以氯唑沙宗作为CYP2E1探针底物，代谢产物为6-羟基氯唑沙宗。100μL孵育体系包括肝微粒体蛋白、氯唑沙宗溶液和磷酸盐缓冲液。NADPH启动反应，冰水浴终止反应，乙酸乙酯萃取，氮气吹干，复溶后高效液相色谱仪测定。计算酶动力学参数：米氏常数（Michaelis-menten constant，Km）、最大反应速率（maximum velocity，Vmax）和清除率（intrinsic clearance，CLint）。　　5.POR基因多态性测定　　选取的4个POR位点rs10954732（G＞A）、rs2286822（C＞T）、rs1135612（A＞G）和rs1057868（C＞T）在中国人群中分布频率均大于1%。抽提人肝组织DNA，采用SNP MassARRAY方法进行基因分型检测。　　6.Label-free定量蛋白质组学方法鉴定肝组织蛋白　　组织提取全蛋白后酶切得到肽段溶液，小反向色谱柱法洗脱、收集组分，质谱检测。数据采用MaxQuant软件搜库分析。采用归一化处理的基于峰面积的无标定量（intensity-based absolute protein quantification，iBAQ）值表示蛋白的表达水平。差异蛋白鉴定标准为表达差异倍数大于1.2倍且P＜0.05。　　本研究从105例正常和102例癌旁肝组织中根据随机数表法分别抽取41和71例进行样品制备和质谱分析，根据数据质控标准，最终选取34例正常和61例癌旁肝组织的质谱数据进行差异蛋白鉴定、筛选和后续分析。　　结果：　　1.POR基因多态性与HCC易感性关联分析　　1.1 POR基因多态性与HCC易感性　　POR位点rs10954732（G＞A）中，与携带GG基因型人群相比，携带GA基因型人群患HCC的可能性降低（OR=0.30，95%CI：0.11~0.78，P=0.014），携带GA+AA基因型（发生基因变异）人群患HCC的可能性降低（OR=0.35，95%CI：0.14~0.88，P=0.026）；G与A等位基因之间、GG与AA基因型之间以及GG+GA与AA基因型之间均未发现HCC易感性。结果提示，POR位点rs10954732基因变异可能减少HCC的发生风险。POR位点rs2286822、rs1135612和rs1057868的基因多态性与HCC发生风险无明显关系。　　1.2 POR位点rs10954732基因多态性与临床血液指标　　在HCC组中，基因变异人群的ALT和AST水平降低（P=0.027；P=0.005），提示POR位点rs10954732基因变异可能一定程度改善肝功能；正常人群ALT和AST的表达水平与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。　　1.3 POR位点rs10954732基因多态性与CYP2E1活性　　在HCC组中，基因变异人群的V2E1和CL2E1降低（P=0.038；P=0.017），提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与CYP2E1活性降低有关；正常人群CYP2E1活性与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。　　2.POR位点rs10954732的HCC易感性蛋白质组学研究　　2.1 差异蛋白鉴定　　鉴定到34例正常和61例癌旁组织的差异蛋白共1360个，根据差异显著程度，P＜0.01、0.01≤P＜0.03和0.03≤P＜0.05的差异蛋白数量分别为640、425和295个。与正常组相比，HCC组中包含上调蛋白814个和下调蛋白546个。　　将HCC组分为GG和GA+AA亚组鉴定差异蛋白，其中GG亚组16例，GA+AA亚组44例，剔除1例未检测到基因型的样本。共鉴定到亚组差异蛋白345个，根据差异显著程度，P＜0.01、0.01≤P＜0.03和0.03≤P<0.05的差异蛋白数量分别为80、144和121个。与GG亚组相比，GA+AA亚组中包含上调蛋白315个和下调蛋白30个。　　2.2 亚组差异蛋白基因本体（GO）分析　　对亚组的345个差异蛋白从细胞组分、分子功能和生物过程等3个层面进行GO分析。细胞组分层面，亚组差异蛋白主要位于细胞器内膜、内质网腔、胞质核糖体、锚定连接和溶酶体等部位；分子功能层面，亚组差异蛋白主要涉及氧化还原酶活性、核糖体结构组成、细胞粘附分子结合、葡糖基转移酶活性、用于CH-OH基团的氧化还原酶活性、涉及异型细胞-细胞粘附的蛋白结合和电子传递活性等；生物过程层面，亚组差异蛋白主要参与蛋白质靶向输送、线粒体氧化呼吸链复合体装配、蛋白质折叠、细胞色素复合体装配、细胞蛋白分解代谢过程、内质网应激反应调控、一元羧酸代谢过程、T细胞介导的免疫和脂质分解代谢过程等。　　2.3 候选差异蛋白的筛选及分析　　2.3.1 差异蛋白的归类及筛选　　进一步，筛选可能与POR位点rs10954732基因变异保护作用有直接关联的蛋白。HCC组差异蛋白与基因变异亚组差异蛋白的交集蛋白共70个。根据GO、GeneCards和NCBI PubMed数据库将这些蛋白按照代谢、炎症、免疫、基因多态性和其他（others）等5类进行归类，每个蛋白可归属多类，共纳入了52个蛋白。　　2.3.2 候选蛋白表达与临床指标　　HPN与正常组相比，HCC组HPN表达显著下调（P=1.00×10-6）。在HCC组中，基因变异人群HPN表达上调（P=0.014），提示POR位点rs10954732基因变异的保护作用可能与HPN表达增加有关；正常人群HPN的表达与POR位点rs10954732基因多态性无明显关系。将HCC组根据HPN表达分成低表达组和高表达组，高表达组AST和GGT的水平降低（P=0.008；P=0.006），ALT和GLO也呈现降低趋势（P=0.072；P=0.074），提示HPN可能一定程度改善肝功能。Kaplan-Meier生存分析显示，高表达组HCC患者的生存时间明显延长（Plog-rank=0.0057），提示HPN可能抑制HCC发展。ROC曲线下面积为0.792（P=3.00×10-6），提示HPN具有一定的HCC预测标志物价值。　　结论：　　1.POR位点rs10954732（G＞A）基因变异降低HCC发生风险，其保护作用可能与CYP2E1活性降低，以及HPN、CXADR、DHRS3、RAP2C、ECH1和DSP表达增加有关。其中，CXADR高表达的HCC患者CYP2E1活性降低。　　2.HPN高表达的HCC患者生存时间延长。

目录

声明

中英文对照缩略词表

前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 试剂与耗材

1.2 实验仪器

2 实验方法

2.1 人肝标本及临床资料收集

2.2 人肝微粒体制备

2.3 肝微粒体蛋白浓度测定

2.4 CYP2E1活性测定

2.5 POR基因多态性测定

2.6 Label-free定量蛋白质组学方法鉴定肝组织蛋白

2.7 统计学分析

结果

1 POR基因多态性与HCC易感性关联分析

1.1 人肝组织样本基本人口学特征和临床特征

1.2 Hardy-Weinberg平衡检验

1.3 POR基因多态性与HCC易感性

1.4 POR位点rs10954732基因多态性与临床血液指标

1.5 POR位点rs10954732基因多态性与CYP2E1活性

2 POR位点rs10954732的HCC易感性蛋白质组学研究

2.1 研究路线和差异蛋白鉴定

2.2 亚组差异蛋白GO分析

2.3 候选差异蛋白的筛选及分析

讨论

结论

参考文献

综述:人细胞色素P450氧化还原酶基因多态性与细胞色素P450酶活性

参考文献

个人简历、硕士期间发表论文

致谢