鱼腥草挥发油抗淋巴瘤药效学及其固体脂质纳米粒的制备研究

摘要

淋巴瘤是一种血液系统性恶性肿瘤，其中非霍奇金淋巴瘤（ non-Hodgkin lymphoma，NHL）约占90％[1-3]。NHL分为B细胞和T细胞两种类型，其中B细胞型NHL发病率在80%以上。B细胞型NHL中最为常见的是弥漫性大B细胞淋巴瘤( diffuse large B-celllymphoma，DLBCL)，DLBCL属侵袭性淋巴瘤，迫切需要临床治疗上的突破[4-5]。　　鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)属三白草科植物，其味辛，性微寒，主要用于治疗肺痈吐脓、热痢热淋、痛肿疮毒等证状。鱼腥草主要成分为挥发油部分[6]。鱼腥草挥发油（volatile oil from Houttuynia cordata Thunb Herba, HHO）对肺炎、慢性宫颈炎等均有较好的疗效，对急性结膜炎也有一定疗效[7-8]。因此，有关HHO药理作用的研究成为了热点。　　前期实验表明，HHO能显著抑制弥漫大 B细胞淋巴瘤SUDHL-4细胞生长增殖。故本文从 HHO的体外抗非霍奇金淋巴瘤作用，体内药效学研究以及其固体脂质纳米粒的制备三个方面来对 HHO进行研究，为鱼腥草作为一种新的抗肿瘤中药的研究提供科学依据。　　1. HHO体外诱导SUDHL-4细胞凋亡研究　　采用 CCK-8法检测 HHO作用后细胞的生长抑制率，FITC-Annerxin V/PI双染法和 PI单染法分别检测 HHO作用后细胞凋亡率和周期变化，光学显微镜和荧光显微镜下观察 HHO作用后细胞形态学变化和凋亡状态，最后通过磷酸化抗体芯片来研究HHO诱导细胞的凋亡通路。　　CCK-8法结果表明，HHO对 SUDHL-4细胞有明显的抑制作用且有时间和浓度依赖性。24h的抑制率最高达77.55%，IC50为0.3198μL/mL；作用48h的抑制率最高达84.35%， IC50为0.2329μL/mL；作用72h的抑制率最高达90.94%，IC50为0.2001μL/mL,各组间具有统计学差异（P＜0.05）。用浓度分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30μL/mL的 HHO诱导淋巴瘤细胞 SUDHL-4，48h后细胞凋亡率可分别达到（5.95±1.35）%、（13.12±0.28）%、（27.15±0.55）%、（36.35±0.93）%、（76.68±1.01）%、（96.37±0.87）%。周期结果表明HHO能将SUDHL-4细胞阻滞于G2/M期，推测HHO抑制细胞生长的机制可能与阻碍G2/M期DNA和蛋白质的合成有关。不同浓度的HHO作用于SUDHL-4细胞48h后，在光学显微镜下细胞形态发生变化，且细胞数目变少，具有浓度依赖性；荧光显微镜下观察，碎片状的红绿色细胞和胞膜破坏的橙红色细胞随着浓度的增大越来越多，说明凋亡和坏死细胞逐渐增多，HHO可以促进淋巴瘤细胞SUDHL-4的凋亡。运用磷酸化蛋白芯片技术，用CSP100芯片识别多条信号通路中关键蛋白的抗体，得到给药组和空白组的差异，通过选择样本间差异磷酸化位点和其调变倍数，映射到 HHO促进淋巴瘤细胞凋亡的关键蛋白 Bcl-2和关键分支信号通路为 Raf―MEK1/2―ERK1/2―Bcl-2，为 HHO的抗淋巴瘤方面的机制研究提供了有效的科学依据。　　2． HHO体内药效学研究　　建立 SUDHL-4淋巴瘤荷瘤肿瘤模型，将小鼠随机分为5组：阳性对照长春新碱1mg/kg组、HHO230mg/kg、150mg/kg、HHO70mg/kg组及阴性对照组。治疗期间每天测量瘤体大小，治疗结束后将肿瘤及组织剥离，称量瘤重并计算抑瘤率，并对肿瘤及组织进行HE染色观察细胞形态学变化。　　结果表明，HHO对于淋巴瘤有明显抑制作用，且具有浓度依赖性。随着HHO浓度的增加，药物对淋巴瘤的抑制率也不断增加，最高可达到51.82%。肿瘤切片表明，与阴性组比较，肿瘤细胞随着浓度的增加，细胞间隙越来越大，结构轮廓越来越模糊，周围结缔组织生长，说明 HHO对于淋巴瘤有生长抑制作用且长春新碱组对于淋巴瘤有明显的抑制作用。小鼠内脏切片表明，低浓度时给药时,小鼠的肝脏出现病理变化，而高浓度给药时，肝脏和脾脏都出现了不同程度的病理变化，说明 HHO经腹腔注射给药时对小鼠的肝脏和脾脏有损伤。　　3．制备鱼腥草挥发油-固体脂质纳米粒　　采用熔融超声乳化法制备鱼腥草挥发油固体脂质纳米粒（Volatile oil from Houttuyniae Herba- Solid lipid nanopartcles，HHO-SLN）,经过单因素考察，正交试验来筛选最佳制备工艺和最优处方,并从外观形状、粒径电位分布、包封率、载药量和稳定性等方面对 HHO-SLN进行制剂学评价。最终优化制备工艺处方为：单硬脂酸甘油酯用量为0.25%，复合乳化剂用量为3%，泊洛沙姆和蛋黄卵磷脂的用量比例为3:1，用药量为1%，吐温80用量为0.5%。恒温磁力搅拌下缓慢地将水相加入相同温度的油相中，均匀搅拌20min后制成初乳，将初乳超声分散15min，振幅100%，室温自然冷却后用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为HHO-SLN。　　制得的 HHO-SLN呈规则圆球形，粒径较小，分布均匀，平均粒径为（42.89±2.13）nm,粒径在10nm-100nm之间的纳米粒总量占全部纳米粒的比例为91.8%，平均 Zeta电位为（?20.4±0.78）mv,体系比较稳定均一。包封率载药量分别为（91.49±2.40）%、（6.08±0.42）%。稳定性实验表明，高温强光照都会影响制剂的稳定性，使粒径增大，包封率降低。初步稳定性试验表明， HHO-SLN应该避光密封保存在4℃条件下，才能保持制剂外观一直澄澈透明无杂物。　　本文研究表明，HHO在体内外均可以诱导大 B弥散性淋巴瘤 SUDHL-4细胞的凋亡，且与中药提取物长春新碱相比，毒性较小。将 HHO制备成HHO-SLN实现了液体药物固态化，并且提高了药物的稳定性和生物利用度，制备出的HHO-SLN制剂学性质稳定，具有生产实用性。

目录

声明

引言

第一章研究背景

1 鱼腥草挥发油

2 固体脂质纳米粒

第二章 HHO诱导SUDHL-4淋巴瘤细胞凋亡的初步研究

1实验材料

2 方法

3 结果

4讨论

第三章 HHO体内抗淋巴瘤药效学研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章鱼腥草挥发油固体脂质纳米粒的制备及其质量评价

1 实验材料

2方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第五章 结论

参考文献

个人简历

致谢