右美托咪定对机械通气肺损伤大鼠细胞凋亡及JNK信号通路的影响

摘要

背景与目的：　　实施全身麻醉以及抢救危重症患者时，机械通气是一种不可或缺的呼吸支持手段。然而，机械通气是一把双刃剑，在提供氧供的同时，其本身又可以作为一种损伤因素来诱发机械通气肺损伤（VILI，ventilator-induced lung injury）。临床及动物实验研究表明，在接受机械通气前，无论肺功能是否受损，使用呼吸机行大潮气量的机械通气都会导致不同程度的肺损伤。　　VILI的发生原因有很多，其是各种损伤因素相互作用的结果，具体机制尚不完全清楚。VILI包含机械伤及生物伤，其中生物伤，即肺部急性炎性损伤，是目前的研究热点。在多种损伤因素（诸如缺血、缺氧、氧化应激及炎症等）所致的肺损伤发生、发展过程中，细胞凋亡的作用日益得到重视。近年来的研究发现，MAPK信号转导通路的激活是 VILI的发生机制之一，其中，c-Jun氨基末端激酶（JNK，c-Jun N-terminal kinase）信号转导通路（MAPKs家族中一条重要的通路）具有介导炎症反应以及细胞凋亡的作用，但是，它是否参与到过度机械通气诱导的肺组织细胞凋亡，与之相关的国内外报道还较少。　　右美托咪定（Dex，dexmedetomidine），一种新型的、高选择性的α2-肾上腺能受体激动剂，兼有抑制交感神经、镇痛、镇静以及抑制儿茶酚胺释放等作用，且有呼吸抑制作用轻微的优势。Dex可对心脏、脑以及肾脏等器官产生保护作用，且能够明显的减轻VILI时肺部的炎症反应。目前的研究也已证实，Dex具有抗组织损伤以及抗细胞凋亡的作用，但对VILI时的细胞凋亡是否有效及其具体机制（如对细胞凋亡相关的信号转导通路的激活）尚未明了。　　本研究拟采用大潮气量机械通气的方法来复制大鼠VILI的模型，并在进行大潮气量机械通气前干预使用不同剂量的Dex，观察Dex对VILI大鼠肺组织损伤、细胞凋亡以及JNK信号转导通路激活的影响，进一步探讨Dex对VILI大鼠的肺保护作用及其机制。　　材料与方法：　　按照随机数字表法将48只健康、雄性的SD大鼠均分为6组（n=8）：C组，N组，H组，H+D1组，H+D2组，H+D2+Y组。C组为保留自主呼吸组；N组为常规潮气量通气，VT8 ml/kg，RR70次/分；H组、H+D1组、H+D2组及H+D2+Y组均为大潮气量通气，VT20 ml/kg，RR50次/分。其中，在对大鼠行机械通气前，H+D1组和H+D2组分别经静脉推注（>10 min推注完毕）2.5μg/kg和5μg/kg的右美托咪定稀释液，H+D2+Y组在静脉推注右美托咪定前30 min静脉推注0.1 mg/kg的育亨宾稀释液。C组、N组和H组静脉推注同等量的生理盐水。按上述各组设置调整呼吸参数，FiO2=21％（吸入气体为室内空气），吸呼比为1:2，通气时间为4 h。机械通气结束后，腹主动脉放血至大鼠死亡。取肺组织：右肺上叶，液氮冷冻30 min后置于-80℃冰箱保存，待做Western blot测定肺组织中JNK与p-JNK蛋白质含量；右肺中叶石蜡包埋后切片待做病理学检测、免疫组化和TUNEL；右肺下叶，称量湿重后于60℃恒温箱中放置72 h以上至恒重，称量干重，测定湿/干重比值。灌洗左肺，回收BALF，离心取适量上清液分装密封，置-80℃冰箱冻存，待测定BALF中总蛋白的含量。　　结果：　　1肺组织湿/干重（W/D）比值变化　　与C组相比，N组大鼠肺组织W/D差异无统计学意义（P>0.05），而H组大鼠肺组织W/D明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与H组相比，H+D1组大鼠肺组织W/D差异无统计学意义（P>0.05），而H+D2组大鼠肺组织W/D明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与H+D2组相比，H+D2+Y组大鼠肺组织W/D明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　2 BALF中总蛋白含量的变化　　与C组相比，N组大鼠BALF中总蛋白的浓度差异无统计学意义（P>0.05），而H组大鼠BALF中总蛋白的浓度明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与H组相比，H+D1组大鼠BALF中总蛋白的浓度差异无统计学意义（P>0.05），而H+D2组大鼠BALF中总蛋白的浓度明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与H+D2组相比，H+D2+Y组大鼠BALF中总蛋白的浓度明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　3肺组织病理学的变化　　C组大鼠肺组织未见明显的病理学改变，肺组织结构正常；N组大鼠肺组织有较轻微的病理学改变，仅有少量的炎症细胞浸润；与 C组大鼠相比，H组大鼠肺组织可见较严重的病理学改变，肺组织结构较紊乱，肺泡壁断裂及增厚，部分肺泡腔内有较多淡红色渗出液、出血及炎性渗液积聚，肺泡间有大量的炎症细胞浸润；H+D1组大鼠肺组织病理学改变与H组相似；与H组大鼠相比，H+D2组大鼠肺组织病理学改变明显减轻，肺泡腔内浆液和炎症细胞明显减少；与H+D2组大鼠相比，H+D2+Y组大鼠肺组织病理学改变加重，肺泡壁断裂及增厚，肺泡间的浆液和炎症细胞增多。　　4肺组织细胞凋亡情况（TUNEL法）　　C组肺组织内未见凋亡细胞；N组肺组织内可见极少量的阳性细胞；H组肺组织结构紊乱，阳性细胞数量明显增加；H+ D1组肺组织内凋亡细胞情况与H组相似；H+D2组肺组织内阳性细胞较H组明显减少；H+D2+Y组肺组织内阳性细胞较H+D2组明显增多。其中，阳性细胞多为肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞及小气道上皮细胞，部分可见于浸润的炎性细胞及间质细胞。肺组织 AI变化：H组大鼠肺组织AI较C组和N组显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与H组相比，H+D1组大鼠肺组织AI差异无统计学意义（P>0.05），而H+D2组大鼠肺组织AI明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与H+D2组相比，H+D2+Y组大鼠肺组织AI明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　5肺组织内p-JNK蛋白表达分布情况（免疫组化法）　　C组和N组肺组织内可见个别的阳性细胞；H组肺组织内阳性细胞数量显著增加，蛋白表达明显增多；H+D1组肺组织内蛋白表达情况与H组相似；H+D2组肺组织内蛋白表达较H组明显减少；H+D2+Y组肺组织内蛋白表达较H+ D2组明显增多。其中，阳性细胞多分布于肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞及支气管上皮细胞，部分见于浸润的炎性细胞以及间质细胞。肺组织中 p-JNK蛋白表达水平（a*b积分表示）变化：与C组相比，N组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），而H组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与H组相比，H+D1组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），而H+D2组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与H+D2组相比，H+D2+Y组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。可见，肺组织中p-JNK蛋白表达量及分布情况与肺组织内凋亡细胞情况大体上一致。　　6肺组织内JNK及p-JNK蛋白表达情况（Western blot法）　　各组大鼠间肺组织中JNK蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。　　与C组相比，N组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05），而H组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与H组相比，H+D1组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05），而H+D2组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与H+D2组相比，H+D2+Y组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　结论：　　1. JNK信号转导通路的激活参与介导了VILI中肺组织细胞凋亡；　　2. Dex可通过阻断JNK信号转导通路，减少VILI中肺组织细胞凋亡，进而起到肺保护作用。

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缩略词表

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 各组大鼠肺组织湿/干重比值（W/D）

2 各组大鼠BALF中总蛋白的含量

3 各组大鼠肺组织病理学结果

4 各组大鼠肺组织细胞凋亡情况

5 各组大鼠肺组织中p-JNK蛋白表达分布情况（免疫组化结果）

6 各组大鼠肺组织中 JNK和 p-JNK蛋白表达情况（Western blot结果）

讨论

1 大鼠机械通气肺损伤及其相关机制

2 右美托咪定与大鼠机械通气肺损伤

结论

展望

参考文献

综述:机械通气相关肺损伤的发生机制及治疗进展

个人简历及在校期间发表的学术论文

致谢