不同光周期对不同秋眠型苜蓿phyA和phyB mRNA相对含量的影响

摘要

我国近几年由于种植业结构的调整和畜牧业的迅猛发展，苜蓿的种植面积急剧扩大，解决生产上迫在眉睫的品种秋眠性选择以及探讨国际上秋眠机理不清所带来的困扰，急需我国在秋眠性研究上有所突破。目前对苜蓿秋眠性机理研究很比较少，仅从一些形态学变化和生理生化指标水平上的差别等来研究苜蓿的秋眠性，但这并非是调控苜蓿秋眠的根本原因，因此迫切需要一种更先进的方法对苜蓿秋眠性的机理及其调控进行研究。有研究表明，光敏色素与苜蓿的秋眠性相关，而光敏色素家族至少包含有两种光敏色素基因A和B，且这些光敏色素之间都相互联系、相互制约。低温和短日照是引起苜蓿秋眠性的主要环境因子，phyA、phyB作为主要的光受体调节苜蓿的秋眠，为探讨phyA、phyB在苜蓿秋眠中的调控机理，本试验分为两个部分，温度试验：试验在短日照（8h）的情况下，研究不同温度5℃、15℃、25℃、35℃对秋眠型苜蓿（Vernal）phyA、phyBmRNA相对含量的影响；光周期试验：采用SYERGreen荧光染料法来测定不同光周期（8h、12h、16h）和（6h、12h、18h）对三种秋眠型苜蓿phyA、phyBmRNA相对含量，首先，选取紫花苜蓿叶片为材料，利用蒺藜状苜蓿的肌动蛋白基因设计特异性引物，扩增出目的基因的cDNA进行测序，测序结果在NCBI基因库中利用Blast与其他高等植物肌动蛋白基因序列进行了比对、分析，结果证明所提取的基因为紫花苜蓿肌动蛋白基因的片段，因此，可以进行下一步mRNA的相对定量。 温度试验采用半定量RT-PCR方法（灰度分析），来测定在8h（短日照）条件下，不同温度处理对秋眠型苜蓿（二级品种——佛拿尔）phyA、phyBmRNA相对含量的影响，试验证明phyA在较低温度情况下合成量较低，温度较高时合成量较高，而phyB在较低温度的条件下合成量显著高于在较高温度条件下合成量，这说明phyA、phyB确实存在在互作效应，或者也可能是与其他光敏色素家族成员产生互作，在低温短日照条件下phyB合成量高，这说明phyB在调控秋眠中发挥了更重要的作用。 光周期试验采用FQ-PCRSYBR-Green方法测定不同光周期条件下不同秋眠型苜蓿phyA、phyBmRNA的表达，试验证明，在短、中日照情况下，phyA、phyBmRNA含量较高，长日照情况下phyA、phyBmRNA合成量较小，其中phyB合成量规律与其在蛋白水平的表达基本一致，试验也再次验证了秋眠型苜蓿的phyBmRNA的含量远远高于半秋眠型、非秋眠型苜蓿，秋眠二级phyBmRNA的表达在不同光照时间条件下，差异极显著，在短、中日照情况下的合成量远远高于在长日照条件下phyB的合成量，而秋眠五级和秋眠八级苜蓿规律不明显；phyA的此规律也不明显，这也再次印证了phyB在调控苜蓿秋眠中的巨大作用，这也与短日照条件下温度试验phyB合成量较高的结论一致，再次说明了phyB在苜蓿秋眠中重大作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1 文献综述

1.1 苜蓿秋眠性

1.1.1 苜蓿秋眠性的概念

1.1.2 苜蓿秋眠性的生理生化特性研究

1.2 光敏色素研究进展

1.2.1 光敏色素的发现

1.2.2 光敏色素的种类和结构

1.2.3 光敏色素分子基因及作用方式

1.2.4 光敏色素的生理功能

1.3 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术及其应用

1.3.1 FQ-PCR的原理

1.4.2 FQ-PCR的定量方法

1.3.3 FQ-PCR的特点

1.3.4 FQ—PCR的应用

2 引言

3 材料与方法

3.1 试验设计

3.1.1 不同温度试验阶段

3.1.2 不同光周期试验第一阶段

3.1.3 不同光周期试验第二阶段

3.2 试验材料

3.2.1 样品、菌株

3.2.2 主要试剂

3.2.3 主要仪器设备

3.2.4 实验所用溶液及其配制

3.3 RT—PCR、FQ—PCR方法的建立

3.3.1 引物的设计和合成

3.3.2 紫花苜蓿总RNA的提取

3.3.3 扩增产物的纯化

3.3.4 PCR产物的测序与序列比对

3.3.5 反转录PCR

4 结果

4.1 紫花苜蓿肌动蛋白基因片段的扩增

4.1.1 总RNA提取与检测

4.1.2 基因普通RT—PCR结果

4.1.3 RT—PCR产物测序结果

4.1.4 测序结果的相似性检索

4.2 紫花苜蓿Actin、phyA、phyB FQ—PCR扩增片段的鉴定

4.2.1 图3—1 紫花苜蓿的Actin、phyA、phyB片段琼脂糖凝胶电泳图

4.2.2 Actin的鉴定

4.2.3 phyA的鉴定

4.2.4 phyB的鉴定

4.2.5 phyA、phyB与Actin荧光定量PCR引物熔解曲线图

4.2.6 phyA、phyB与Actin试验样品荧光定量PCR扩增曲线

4.3 不同温度对秋眠型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA丰度的影响

4.4 不同光周期对不同秋眠型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA相对含量的影响

4.4.1 大苗不同光周期对不同秋眠型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA相对含量的影响

4.4.2 小苗不同光周期对不同秋眠型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA相对含量的影响

4.5 不同秋眠型紫花苜蓿相同光周期phyA、phyB mRNA相对含量的变化规律

4.5.1 大苗不同秋眠型紫花苜蓿相同光周期phyA、phyB mRNA相对含量的变化规律

4.5.2 小苗不同秋眠型紫花苜蓿相同光周期phyA、phyB mRNA相对含量的变化规律

5 讨论

5.1 紫花苜蓿肌动蛋白基因片段的扩增

5.2 不同温度对秋眠型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA相对含量相对含量的影响

5.3 不同光周期对不同秋眠型紫花苜蓿phyA、phyB mRNA相对含量的影响

5.4 展望

6 参考文献

附件