黑斑蛙和中华大蟾蜍AQPs基因克隆及组织表达研究

摘要

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是存在于细胞膜上的一种跨膜蛋白家族，与水分子的快速转运有关，在渗透压的作用下，具有增加细胞膜水通透性的功能，在维持生物体体内水分的动态平衡方面发挥着关键的作用。故对AQPs进行基因克隆以及在不同组织中的表达分析，来推测其在不同组织中的生理学作用，进而预测它们在脊椎动物渗透压调节和通过体表水分蒸发体温调节中的作用，为阐明其新的生物学功能奠定理论基础。 两栖动物和哺乳动物AQP的系统进化树表明：无尾目动物AQPs可以分为六种聚类：即1、2、3、5和无尾目动物特异性的a1和a2（字母“a”代表anuran）。本试验应用RT-PCR方法从黑斑蛙（R.ana nigromaculat）和中华大蟾蜍（Bofu gargarizans）的不同组织中扩增获得AQP1、AQP3、AQP5、和看家基因β-actin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase，GAPDH）以及黑斑蛙的AQPa2的部分编码序列；并通过半定量RT-PCR分析了AQP1基因mRNA在黑斑蛙和中华大蟾蜍不同组织中的表达情况。 具体研究内容包括： （1）在Genbank中查找非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）、灰树蛙（Hyla chrysoscelis）、日本树蛙（Hyla japonica）等物种的AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2基因和看家基因β-actin、GAPDH序列，并根据其编码区设计引物；提取黑斑蛙和中华大蟾蜍不同组织的总RNA，采用RT-PCR技术分别扩增黑斑蛙AQPA、AQP3、AQP5、AQPa2和看家基因β-actin、GAPDH的部分序列，以及中华大蟾蜍AQP1、AQP3、AQP5和看家基因β-actin、GAPDH的部分序列，将此片段与PMD18-T载体连接，转化到感受态细胞中，进行蓝白斑筛选以及阳性克隆鉴定后测序。 （2）以β-actin为内参基因，应用RT-PCR方法检测AQP1在黑斑蛙和中华大蟾蜍不同组织中的表达情况。 研究结果显示： （1）将测序结果在GeneBank上进行序列相似性搜索，发现试验中所克隆的两种两栖动物的11条基因序列分别对应于不同物种中的AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2、GAPDH和β-actin基因片段，此结果证实，所克隆的序列分别为黑斑蛙AQPA、AQP3、AQP5、AQPa2、β-actin和GAPDH的部分cDNA序列，以及中华大蟾蜍的AQP1、AQP3、AQP5、β-actin和GAPDH的部分cDNA序列。利用DNAMAN软件推导出所得基因片段的氨基酸序列，与其他物种相应氨基酸序列进行同源性分析，结果表明：黑斑蛙与食用蛙（Rana esculenta chip）AQPA的氨基酸相似性最高为97.6％，遗传距离最小；而中华大蟾蜍AQP1的氨基酸序列与其他物种的相似性较低。黑斑蛙与灰树蛙、日本树蛙的AQP3氨基酸序列相似性最高，均为96.9％，遗传距离最小；中华大蟾蜍和灰树蛙、日本树蛙的AQP3氨基酸序列相似性最高，均为91.9％，遗传距离最小，并且与黑斑蛙AQP3的氨基酸序列同源性为90.7％。中华大蟾蜍和黑斑蛙与美洲巨蟾蜍（Bufo marinus）的AQP5氨基酸序列相似性较高，均为95.9％，遗传距离较小；黑斑蛙的AQPa2与美洲巨蟾蜍AQP-t3和美洲巨蟾蜍AQP-t2以及日本树蛙AQP-h3和日本树蛙AQP-h2氨基酸序列具有较高的同源性，相似性分别为83.7％、66.3％、83.2％和66.3％。系统发育分析表明：两栖动物的AQP可以分为6个聚类，聚类结果与形态学特征和传统分类学中的进化地位是基本一致的；其中黑斑蛙和中华大蟾蜍AQP1、AQP3和AQP5与哺乳动物相对应的基因为同一亚族。 （2）AQP1组织分布的半定量RT-PCR研究结果显示：AQPA在黑斑蛙的膀胱、背部皮肤、腹部骨盆皮肤、腹部皮肤、脑和肾脏中均有表达；AQP1在中华大蟾蜍的膀胱、背部皮肤、腹部骨盆皮肤、腹部皮肤、肺和肾脏中均有表达。凝胶电泳条带灰度分析的结果表明：AQPA基因在黑斑蛙的膀胱中的表达水平最高，脑次之，而在腹部骨盆处皮肤和腹部皮肤中表达水平较弱；AQP1基因在中华大蟾蜍的腹部皮肤中的表达最高，腹部盆骨处皮肤次之。AQP1mRNA在不同组织中表达量的差异可能与这些组织对水分的转运能力不同有关；膀胱中的高表达可能与两栖动物以膀胱为主要摄取水分途径相关。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1 文献综述

1.1 哺乳动物的水通道蛋白的研究现状

1.1.1 水通道蛋白的发现以及分类

1.1.2 水通道蛋白的结构

1.1.3 水通道蛋白的作用机理

1.1.4 水通道蛋白的组织分布

1.1.5 水通道蛋白的功能

1.1.6 水通道蛋白的调节

1.2 两栖动物的水通道蛋白的研究现状

2 引言

3 材料与方法

3.1 材料

3.1.1 组织来源

3.1.2 载体和宿主菌

3.1.3 引物

3.1.4 主要仪器设备

3.1.5 主要试剂

3.1.6 主要试剂配置方法

3.2 试验方法

3.2.1 基因克隆

3.2.2 半定量RT—PCR

4 结果

4.1 黑斑蛙与中华大蟾蜍AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2、GAPDH和β—actin基因的克隆

4.1.1 总RNA的提取

4.1.2 黑斑蛙与中华大蟾蜍AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2、GAPDH和β—actin基因的RT—PCR扩增

4.1.3 AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2、GAPDH和β—actin基因阳性克隆的测序

4.2 AQP1、AQP3、AQP5、AQPa2、GAPDH和β—actin基因序列分析

4.2.1 序列分析

4.2.2 同源性分析和聚类分析

4.3 AQP1 基因的组织特异性表达分析

4.3.1 健康成体黑斑蛙的AQP1 基因的空间特异性表达分析

4.3.2 健康成体中华大蟾蜍的AQP1 基因的组织特异性表达分析

5 讨论

5.1 黑斑蛙和中华大蟾蜍AQP基因

5.2 黑斑蛙和中华大蟾蜍AQP基因系统进化分析

5.3 黑斑蛙和中华大蟾蜍AQPA/AQP1基因在不同组织中的特异性表达

5.4 全文的结论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文及在GeneBank上注册的基因号