结核分枝杆菌H37Rv组氨醇脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

摘要

结核病是人类健康的大敌，每年导致约300万人死亡，同时全球有将近三分之一的人口(20亿)受到结核分枝杆菌的感染。由于耐药菌株的出现，在治疗结核病时，人类将面临无药可用的危险处境。2006年9月，世界卫生组织发出警示：对目前所有药物耐受的广泛耐药结核杆菌已经出现。鉴于此，新型抗结核药物的研发迫在眉睫。 基于药物靶标的新药开发是目前广为采用的新药开发策略。利用这种策略开发新药，需要识别可作为药物靶标的蛋白，并获得该蛋白的三维结构数据，再利用从头设计或者虚拟筛选获得具有抑制作用的先导化合物。 以潜伏状态在宿主体内长时间持留，是结核分枝杆菌致病的重要特性，也是结核病治疗周期长的原因之一。目前大多数药物仅对生长期的结核杆菌有效，因此，开发针对潜伏期结核杆菌的新型抗结核药物意义重大。 我们以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，扩增hisD基因，构建pET-28a-HDH重组质粒；转化重组质粒到Ecoli BL21(DE3)并诱导表达，纯化可溶性的结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶(HDH)，并对其性质进行研究，结果表明：重组结核分枝杆菌L．组氨醇脱氢酶能以L-组氨醇和NAD<'+>为底物催化L-组氨醇生成L-组氨酸；该酶的最适pH值为8.3，最适温度为45℃，比活力为1.788 L1/mg；Mn<'2+>、Ca<'2+>、Zn<'2+>、CO<'2+>等对酶促反应有激活作用；底物NAD<'+>和L-组氨醇的米氏常数分别为0.9765 mmol/L和2.755μmol/L；25℃时重组蛋白的二级结构中有20.5％的α-螺旋，40.9％β-折叠，4.2％β-转角，34.3％无规卷曲。 总之，本研究论文完成了结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶基因的克隆、表达和纯化，并测定了其酶学特性。这些工作的开展，为基于结构的先导化合物设计和筛选奠定了扎实的基础。

目录

文摘

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声明

第一章前言

1.1结核病概况

1.1.1什么是结核病

1.1.2结核分枝杆菌的生物学特征

1.1.3结核病的症状

1.1.4结核病的传播

1.1.5结核病的预防、诊断及治疗

1.1.6结核病现状

1.2抗结核药物研究进展

1.2.1现有抗结核药物

1.2.2新型抗结核药物的研究进展

1.3新型抗结核药物靶位的研究进展

1.3.1分枝杆菌持续生长相关的基因

1.3.2细胞壁合成相关基因

1.3.3脂类代谢相关基因

1.3.4参与呼吸和抗氧化的基因

1.3.5Sigma因子和毒力因子

1.3.5生长必需基因

1.3.7 PE、PPE家族

1.4 L-组氨醇脱氢酶的研究进展

1.4.1 L-组氨醇脱氢酶简介

1.4.2 L-组氨醇脱氢酶的催化机理

1.4.3 L-组氨醇脱氢酶的催化活性中心

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2生化与分子生物学试剂

2.1.3菌株与载体

2.1.4培养基

2.1.5常用溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1目的基因的克隆

2.2.2 MtHDH的表达

2.2.3 MtHDH的纯化

2.2.4HPLC分析

2.2.5质谱测定

2.2.6 MtHDH酶学性质分析

2.2.7 MtHDH的二级结构研究

2.2.8兔多克隆抗体的制备

2.2.9 ELISA(酶联免疫吸附实验，Enzyme-linked absorbent assay)

第三章结果与分析

3.1目的基因克隆

3.1.1结核分枝杆菌H37Rv株基因组的抽提

3.1.2 RT-PCR结果分析

3.1.3 PCR扩增目的基因

3.2构建pET-28a-HDH表达载体

3.4 HPLC分析和质谱鉴定

3.5 MtHH酶学性质分析

3.5.1 MtHDH酶活初步测定

3.5.2 pH对MtHaDH酶活性的影响

3.5.3温度对MtHDH酶活性的影响

3.5.4 MtHDH的热稳定性

3.5.5金属离子对MtHDH活性的影响

3.6 MtHDH的米氏常数的测定

3.7 MtHDH的二级结构测定结果

3.8 ELISA测定抗血清的效价

3.9小结

参考文献

致谢

个人简历