不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔心脏功能影响的实验研究

摘要

心力衰竭(heart failure，HF)是导致死亡的重要危险因素，而且能增加病人住院治疗日，降低生活质量，提高治疗费用。最近二十年，HF的药物治疗方面取得了重大进步，ACEI、β受体阻滞剂、醛固酮拮抗剂在降低HF病人的发病率和死亡率中有着重要的作用。这些治疗延迟了难治性HF的进展，但是不足以阻止疾病的恶化进程，仍需进一步干预方法。最近几年，机械装置为基础的治疗方法出现，像心脏再同步治疗、心脏辅助装置、优化系统(Impulse Dynamics)。心脏收缩调节(cardiac contractilitymodulation，CCM)作为机械装置治疗方法进入人们视线，它是在绝对不应期内给予的非兴奋性刺激(Non-Excitatory Currents，NEC)即绝对不应期电刺激（absolute refractory period electric stimulation，ARPES），是一种非常有前景的新治疗方法，目前已应用于治疗严重HF的Ⅲ期临床病人。在H人中显示能提高人的提高运动耐量和生活质量，最近研究显示从心肌组织活检中发现，CCM处理能使HF时许多异常基因表达正常化，包括参与钙循环的蛋白质。心脏收缩性调节是非药理学方法使用电流提高肌丝钙效应，是提高HF心脏收缩功能安全的、可行的方法，有报道认为这种方法无致心律失常作用。　　 HF是由于心肌疾病或者心脏外因素损害泵功能引起综合征，表现为心脏功能障碍，尽管心腔充盈充分，心输出量降低，不能满足组织器官代谢需求，同时神经介质激活，在分子水平心肌凋亡和心肌适应性改变。交感神经系统(SAS)和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）在调节心肌收缩力、调节血管反应、维持血流灌注等方面发挥着重要作用。HF时，交感神经系统激活，儿茶酚胺类物质如去甲肾上腺素等释放入血，具有提高心率、正性肌力作用（增加心肌收缩的力量和速度），同时通过收缩组织、肾脏等内脏和皮肤血管，增加了前负荷和后负荷。肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，肾素活化，增加交感神经张力同时，血管紧张素Ⅱ刺激醛固酮加压素产生，导致心肌纤维化和心室重构。　　 本研究通过检测去甲肾上腺素(NE)、肾素(Renin)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)，观察ARPES对SAS、RAAS的影响，探讨其改善心脏功能的神经内分泌机制。　　 B型利钠肽(BNP)是诊断早期HF的重要指标，敏感性90％，特异性76％，其表达水平的高低与HF的NYHA心脏功能分级相关，而且有助于评估HF病人预后，判断HF的治疗是否需要加强。BNP水平升高是HF非常重要的独立预测因子，而且与肾功能无关，也是60天死亡的非常重要预测指标。在一项BNP研究中，1586名因呼吸困难急症入院的病人，HF病人的BNP浓度最高，有非心源性呼吸困难但有心脏功能不全病史病人次之，没有HF或左室功能不全的病人最低，对鉴别HF有重要的价值。　　 慢性和亚临床炎症是HF的病理基础，其主要特征就是全身性炎症反应，因此HF并不仅仅是泵衰竭疾病，而是一种全身性疾病。全身炎症反应表现在炎性因子产生、释放，补体激活以及自身抗体产生，其中细胞炎性因子在HF发病中发挥着重要作用。细胞因子是免疫系统细胞通过神经激素激活产生的，其中最重要的两种是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6(IL-6)。TNF-α引起内皮功能障碍，蛋白质合成减少，分解增加，导致肌肉分解增加，心肌收缩力下降，同时诱导心肌细胞肥大。有研究表明NYHAⅣ级病人TNF-α、IL-6明显升高，可直接影响心脏功能，导致严重运动能力受限。目前对IL-6通过刺激心肌糖蛋白受体130参与心室肥大有了一定的认识。IL-6与NYHA分级、住院治疗时间、左室功能降低相关，它作为预测标记物的作用至今仍没有定论。　　 缝隙连接（Gap junctions，Gj）形成了细胞与细胞电流精确有序的传导通路，支配心脏节律，而其功能与心脏表达connexin43(CX43)、connexin(Cx40)、connexin(Cx45)等缝隙连接蛋白密切相关。缝隙连接蛋白连接异常主要表现在缝隙连接蛋白的分布异常和数量、表达类型改变，与HF的病理生理学有着密切联系。缝隙连接蛋白的表异常达和组织重构在HF的作用已经有报道。在心衰病人和动物模型体内发现CX43表达降低，缝隙连接分布紊乱，这些特征性变化与心律失常、心脏功能不全相关。　　 雷尼丁受体受体（ryanodine receptors，RyRs）本质上是一种钙离子通道。根据RyRs的分布和生物特性的不同，哺乳类动物RyRs可分为RyR1、RyR2、RyR3，其中RyR2主要在心肌细胞中表达。心肌收缩的强弱决定于RyR2释放Ca2+的多少。心肌细胞产生动作电位时，二氢吡啶受体（dihydropyridine receptor, DHPR）介导少量细胞外钙内流，RyR2被激活，细胞内钙库的Ca2+释放到细胞质，引起胞质中游离的Ca2+浓度升高，激活钙调蛋白，启动心肌细胞兴奋-收缩耦联。肌浆网RyR2调控的细胞内Ca2+异常与HF、心律失常、心肌梗死等疾病密切相关。　　 本研究通过评估ARPES的急性效应（左室压力变化如dP/dt等血流动力学参数、心脏功能、心室肌CX43、RyR2、血清BNP表达水平），了解ARPES对HF的影响。综上所述，本实验从SAS、RAAS、细胞炎性因子、心肌CX43和RyR2影响心脏功能的角度，探讨不同强度ARPES影响心脏功能的机制。　　 第一部分、不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔心脏功能的影响　　 目的：观察ARPES对HF兔心脏功能指标、血流动力学指标、血清BNP水平的影响，探讨其是否对HF兔心脏功能具有保护作用。　　 方法：6月龄成年新西兰大白兔，采用升主动脉缩窄法，1个月后建立兔HF模型。开胸术前、术后1个月、ARPES后即刻测量心脏功能及制备血清标本，术后1个月测量血流动力学指标。术中常规监测肢体导联心电图(ECG)，ARPES持续12小时。运用彩色超声心动图仪对假手术组（SHAM组）、心力衰竭组(HF组)、绝对不应期电刺激组（ARPES组）三组兔进行图像采集，二维超声引导下取左室长轴切面，经M超曲线测量舒张末期室间隔厚度(ⅣSd)、舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(EF％)、左室短轴缩短率(FS％)、左心室的舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)，心尖五腔心切面测量主动脉瓣上流速(AV)，心尖四腔心切面观察二尖瓣反流，测量舒张期二尖瓣口血流速度(MV)。颈动脉途径法通过MPA2000心脏功能仪测量左室压最大上升与下降速率(+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin)、左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末期压力(LVEDP)、左室平均压力（LVPmean）、心率(HR)。采用双抗体夹心ABC-ELWASA法检测BNP表达水平。　　 结果：　　 1.一般情况：术前SHAM、HF、ARPES三组间比较体重(W)、心率(HR)、呼吸频率(R)无统计学意义。术后1个月时，HF组、ARPES组HR、R较SHAM显著升高，P＜0.05，而体重有降低，但无统计学意义，P＞0.05。ARPES组、HF组间HR、R、W比较，无统计学意义，P＞0.05。HF组、ARPES组HR、R较术前显著升高，P＜0.05，W无明显变化，P＞0.05。SHAM组HR、R、W较术前无差别，P＞0.05。　　 2.生化指标的改变：术前三组间生化指标均无统计学意义，P＞0.05。ARPES组、HF组肝功能指标（ALT、AST）和心肌酶谱(CK、CK-MB、LDH)较SHAM显著升高，P＜0.05。ARPES组ALT、AST、CK、CK-MB、LDH较HF组有降低，但无统计学意义。三组间比较ALT/AST均无统计学意义。肾功能指标血清（尿素、肌酐、K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+）三组间比较无统计学意义，P＞0.05。HF组、ARPES组血脂(TG、TC)均较SHAM组显著下降，P＜0.05，但VLDL及血糖三组间比较无统计学意义。HF组、ARPES组ALT、AST、CK、CK-MB、LDH较术前显著升高，P＜0.05，血脂TG、TC显著降低，P＜0.05，其他生化指标较术前无统计学意义，P＞0.05。SHAM组生化全项较术前均无差异，P＞0.05。　　 3.绝对不应期电刺激对兔心脏彩超指标的影响：HF组LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV较SHAM组显著升高，P＜0.01，EF、FS、MV显著降低，P＜0.05，而LVPWd、ⅣSd无统计学差异，P＞0.05。ARPES组LVEDD、EDV较HF组有降低，但无统计学意义，LVESD、ESV显著降低，P＜0.01，EF、FS、AV、MV显著升高，P＜0.01，但LVPWd、ⅣSd无统计学意义，P＞0.05。ARPES组LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV较SHAM组显著升高，P＜0.05，EF、FS、MV显著降低，P＜0.01，但LVPWd、ⅣSd无统计学意义，P＞0.05。不同刺激强度（ARPES-L亚组、ARPES-H亚组）对心脏彩超各参数的影响无统计学差异，P＞0.05。HF组、ARPES组LVEDD、LVESD、ESV、EDV、AV较术前显著升高，P＜0.01，EF、FS、MV显著降低，P＜0.05，而LVPWd、ⅣSd无统计学差异，P＞0.05。SHAM组心脏彩超各参数较术前无统计学意义，P＞0.05。　　 相关分析：对心脏射血分数LVEF和LVEDD、LVESD做相关分析表明EF和LVEDD、LVESD(r=-0.6099，-0.8694)呈负相关。　　 4.绝对不应期电刺激对兔血流动力学的影响：ARPES组、HF组LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin绝对值较SHAM组显著降低，P＜0.01。ARPES组LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin绝对值较HF组显著升高，P＜0.01。另外ARPES-H亚组LVSP、LVEDP、LVPmean、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmin绝对值较ARPES-L亚组有升高，但无统计学意义，P＞0.05。　　 5.绝对不应期电刺激对兔血清BNP表达水平的影响：术前三组间BNP表达水平比较无统计学差异，P＞0.05。1个月时ARPES组、HF组BNP表达水平较SHAM组显著升高，P＜0.01，ARPES组较HF组显著降低。ARPES-H亚组BNP表达水平较ARPES-L亚组无统计学差异，P＞0.05。ARPES组、HF组BNP表达水平较术前显著升高，P＜0.01，SHAM组较术前无统计学意义P＞0.05。　　 结论：通过升主动脉缩窄法可成功建立兔HF模型，短期ARPES可增强HF兔心肌收缩力，稳定血流动力学，改善心脏功能。实验提示ARPES增可强心肌收缩力，降低LVESD，从而改善心脏功能，但不同ARPES刺激强度对HF兔心肌收缩力、改善心脏功能和血流动力学的影响无差别。　　 第二部分、不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用　　 目的：通过ARPES后NE表达水平，了解其对SAS的影响。通过观测Renin、AngⅡ、ALD的表达水平，探讨ARPES对RAAS的作用。同时观察低强度、高强度ARPES（ARPES-L、ARPES-H）对SAS、RAAS的影响是否存在差异。　　 方法：SHAM组、HF组开胸术前、术后1个月，ARPES组开胸术前、ARPES后颈内静脉采血，制备血清标本，采用双抗体夹心ABC-ELWASA法检测NE、Renin、AngⅡ、ALD的浓度，观察SAS和RAAS的关系。　　 结果：　　 1.一般情况及生化指标的改变：同第一部分。　　 2.开胸术前SHAM组、HF组、ARPES组NE、Renin、AngⅡ、ALD无统计学意义，P＞0.05。术后SHAM组、HF组NE、Renin、AngⅡ、ALD较SHAM组显著升高，P＜0.01，ARPES组NE、Renin、AngⅡ较HF组显著升高，P＜0.01，但ALD无统计学意义，P＞0.05。SHAM组、HF组NE、Renin、AngⅡ、ALD较术前显著升高，P＜0.01，SHAM组较术前无统计学意义。ARPES-L亚组NE、Renin、AngⅡ、ALD较ARPES-H亚组无统计学意义，P＞0.05。　　 3.NE与Renin、AngⅡ、ALD相关分析表明：血清Renin、AngⅡ、ALD含量与NE(0.8642，0.8329，0.6581，P＜0.01)呈正相关。另外，Renin与AngⅡ(0.8141,P＜0.01)、Renin与ALD(0.6911,P＜0.01)、AngⅡ与ALD(0.6895，P＜0.01)亦呈正相关。　　 结论：HF兔NE分泌增多，SAS激活，Renin、AngⅡ、ALD升高，RAAS系统亦激活，表明SAS、RAAS系统参与了HF的代偿机制，同时参与了HF的发生和发展。ARPES可以启动SAS、RAAS的代偿机制，可能参与了HF的进展。不同强度ARPES对SAS、RAAS的影响不存在差别。　　 第三部分、不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔细胞炎性因子肿瘤坏死因子α、白介素-6的作用　　 目的：观察SHAM组、HF组、ARPES组兔血清细胞炎性因子TNF-α、IL-6的表达水平，了解ARPES对细胞炎性因子的作用，探讨ARPES是否具有保护心脏的抗炎机制。同时对比不同强度ARPES对细胞因子作用的差异。　　 方法：颈内静脉法留取血液，制备血清标本，留置血液时间点为SHAM组、HF组、ARPES组三组于术前，SHAM组、HF组开胸术后1个月，ARPES组刺激处理后即刻。采用双抗体夹心ABC-ELWASA法检测TNF-α、IL-6表达水平。　　 结果：　　 1.术前TNF-α、IL-6表达水平无统计学差异，P＞0.05，开胸术后1个月时HF组、ARPES组TNF-α、IL-6表达水平较SHAM组显著升高，P＜0.01，ARPES组较HF组显著降低，P＜0.01。HF组、ARPES组TNF-α、IL-6表达水平较术前显著升高，P＜0.01，SHAM组较术前无统计学意义，P＞0.05。ARPES-H亚组较ARPES-L亚组TNF-α、IL-6表达水平有降低，但无统计学意义，P＞0.05。　　 2.相关分析：对兔血清细胞炎性因子TNF-α、IL-6表达水平做相关分析表明给予HF兔ARPES处理后TNF-α与IL-6表达水平(0.8582，P＜0.01)呈正相关。血清TNF-α表达水平与Renin、AngⅡ、ALD表达水平(r=0.8676，0.7691，0.6986，P＜0.01)，与NE表达水平(r=0.3402，P＞0.05)无相关关系。血清IL-6表达水平与NE、Renin、AngⅡ、ALD表达水平(r=0.8004，0.8457，0.8208，0.7299，P＜0.01)呈正相关。　　 结论：细胞炎性因子TNF-α、IL-6在HF时表达上调，与SAS、RAAS共同参与了HF的发生和发展。ARPES可抑制HF后细胞炎症反应，但不同强度ARPES对HF兔的细胞炎性反应的作用无显著差异。ARPES改善心脏功能的作用可能被SAS、RAAS激活而部分抵消。　　 第四部分、不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔心肌2型雷尼丁受体、缝隙连接蛋白43的影响　　 目的：观察SHAM组、HF组、ARPES组兔RyR2、CX43在心室肌表达水平变化，了解ARPES对心肌细胞兴奋、收缩以及兴奋收缩偶联的影响，从分子水平探讨非兴奋性刺激的作用机制。　　 方法：开胸术后1个月时SHAM组、HF组、ARPES组留取心肌组织，-80℃下冷冻保存。采用荧光定量PCR法检测左心室心肌组织RyR2、CX43在表达水平。　　 结果：　　 1.开胸术后1个月时HF组、ARPES组RyR2、CX43表达水平较SHAM组显著降低，P＜0.01，而ARPES组较HF组显著升高，P＜0.01。ARPES-L亚组、ARPES-H亚组间RyR2、CX43表达水平比较，无统计学差异，P＞0.05。　　 2.相关分析：对兔心肌组织RyR2、CX43表达水平做相关性分析表明RyR2与CX43表达水平(r=0.5636，P＜0.01)呈正相关。对兔心肌组织RyR2、CX43表达水平和EF、LVSP、+LVdP/dtmax做相关分析，心脏EF、LVSP、+LVdP/dtmax与CX43表达水平(r=0.8350，0.5174，0.7629，P＜0.01)呈正相关，心脏EF、LVSP、+LVdP/dtmax与RyR2表达水平(r=0.6707，0.5480，0.6745，P＜0.01)亦呈正相关。　　 结论：兔HF后RyR2、CX43表达水平下降，心室肌收缩力及心脏功能减低。短期ARPES可以升高RyR2、CX43表达水平，增强心肌收缩力，从而改善心脏功能。CX43在ARPES改善稳定血流动力学、心脏功能方面起着更重要作用，但不同强度ARPES对RyR2、CX43表达水平的作用无差别。ARPES可能改善HF兔的心脏舒张功能。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔心脏功能影响的实验研究

引言

第一部分 不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔心脏功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔细胞炎性因子肿瘤坏死因子α、白介素-6的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 不同强度绝对不应期电刺激对心力衰竭兔心肌2型雷尼丁受体和缝隙连接蛋白43的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 Ryanodine受体及其在心脏疾病中的意义

参考文献

致谢

个人简历