丁苯酞注射液对慢性脑低灌注大鼠脑自由基代谢及PARP蛋白表达的影响

摘要

目的：慢性脑低灌注是血管性痴呆（vascular dementia，VD）、阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）和Binswanger病等多种疾病发展过程中的一个共同病理过程。是指由高血压、脑动脉硬化引起的脑动脉狭窄所致的脑组织灌注长期低于生理阈值而出现的神经系统损害的一种病理状态。慢性脑低灌注作为神经系统的一种常见病理状态，存在于脑动脉硬化、血管性痴呆、AD、Binswanger病及动静脉畸形等多种疾病的病理过程中，发病早期以认知功能损害为主要表现，最终可导致持久或进展性的认知与神经功能障碍。在我国，VD是老年期痴呆的主要组成部分。VD不仅严重损害患者的健康及生存质量，也给社会和家庭带来沉重的负担。目前，VD的发病机制尚不十分清楚，也无特殊有效的治疗方法，因此探讨VD的发病机理，制定合理的治疗方案，是医学领域研究的重要课题。　　 目前认为慢性脑低灌注是VD的主要原因。有研究表明，在低灌注状态及低代谢状态下认知功能可发生减退，而脑部氧化活性的改变可能是低灌注时产生脑实质和脑微血管系统损害的重要机制。大量研究表明，氧化损伤在脑缺血后神经元损伤中起到了关键作用。自由基增多，其清除剂超氧化物岐化酶（SOD）下降，脂质过氧化物增多，其毒性代谢产物丙二醛（MDA）也相应升高，氧自由基的产生导致DNA链断裂，从而激活PARP的活性，活化的PARP在缺血性脑损伤中起重要作用作用。它刺激NAD+耗竭，从而导致ATP耗竭和细胞死亡。学者认为过氧化反应及自由基介导的DNA损伤是由于PARP被激活所致。越来越多的证据表明PARP过度激活在细胞氧化性损伤中起关键作用。　　 丁苯酞注射液是从芹菜种子中分离出的化学成分，具有较强的抗脑缺血作用，可阻断缺血性脑血管病所致脑损伤的多个病理环节，本品可通过降低花生四烯酸含量，提高脑血管内皮NO和PGI2的水平，抑制谷氨酸的释放，降低细胞内钙浓度，抑制自由基和提高抗氧化酶活性等机制而产生药效作用。但国内有关丁苯酞注射液神经保护作用的大部分研究都集中在急性脑缺血模型，有关丁苯酞注射液作用于慢性脑缺血模型的实验研究报道尚缺乏　　 方法：用雄性SD大鼠80只，鼠龄为10周，体重200～250g，随机分为假手术对照组（n=20），生理盐水组（n=20），丁苯酞注射液大剂量组（n=20）（剂量6mg/kg），丁苯酞注射液小剂量组（n=20）（剂量2mg/kg）。每组大鼠行双侧颈总动脉永久结扎术，假手术组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外，余处理同生理盐水组和丁苯酞注射液组。丁苯酞注射液大剂量组手术第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，小剂量组手术第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，均为每日二次，生理盐水组腹腔注射等剂量生理盐水，假手术组不给药，连续给予四周。各组大鼠术后分别在各时间点水迷宫测试后断头，在冰盘上快速取脑，去除脑干及小脑，置0～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干。视交叉后1mm及4mm冠状切开脑组织，取中间切块为海马组织，系列固定、脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片，行HE染色和免疫组化染色观察海马病理变化和海马PARP蛋白表达变化。取视交叉前脑组织分别检测SOD活力和MDA含量。运用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD-t检验进行各组间的两两比较，P<0.05表示有统计学意义。　　 结果：（1）各组大鼠存活情况：假手术组死亡9只，生理盐水组死亡12只，死亡率分别为45％和60％。丁苯酞注射液大、小剂量组各死亡11只，死亡率为55％。各组存活大鼠作为研究对象。（2）水迷宫试验：生理盐水组大鼠学习、记忆成绩显著下降，表现为寻找平台潜伏期时间延长，明显高于假手术组（P<0.05），丁苯酞注射液大、小剂量组分别与生理盐水组比较，学习、记忆成绩均显著改善（P<0.05），与假手术组相比，丁苯酞注射液组仍有所下降（P<0.05），丁苯酞注射液大剂量组与丁苯酞注射液小剂量组比较，学习、记忆成绩均显著改善（P<0.05）。（3）海马HE染色：假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞排列较致密整齐，胞浆内尼氏体丰富，核大而圆，核仁明显，偶有神经元细胞变性和坏死；相比之下，生理盐水组大鼠海马CA1区锥体细胞排列松散，层次不清，有细胞缺失现象，出现炎性细胞浸润，胞体变小，核固缩，胞质浓染，丁苯酞大、小剂量组神经元变性、死亡较生理盐水组减轻，正常神经元数目较生理盐水组多；丁苯酞小剂量组较大剂量组神经元细胞缺失、核固缩现象更明显。（4）海马CA1区PARP蛋白表达变化：假手术组海马CA1区仅见极少量阳性神经元；生理盐水组可见大量阳性神经元意义，排列松散，胞体变小，核固缩，阳性细胞累计光密度（IOD）值高于假手术组（P<0.05），丁苯酞注射液大、小剂量组海马CA1区均可见有大量PARP阳性神经元分布，阳性物质主要位于胞浆内，胞核也有少量表达，细胞排列较整齐紧密，呈棕黄色，胞体较大，圆形或椭圆形，有的可见突起；与假手术组相比，丁苯酞注射液大、小剂量组阳性神经元IOD值增高（P<0.05）；与生理盐水组相比阳性神经元IOD值降低（P<0.05）。丁苯酞注射液大剂量组海马CA1区阳性神经元IOD值与丁苯酞注射液小剂量组相比降低（P<0.05）。（5）SOD、MDA测定结果情况：与假手术组相比，生理盐水组前脑组织SOD活力下降，MDA含量增加（P<0.05）。与生理盐水组相比，丁苯酞注射液大、小剂量组SOD活力有所增加，MDA含量有所下降（P<0.05）。与丁苯酞注射液小剂量组相比，丁苯酞注射液大剂量组组SOD活力明显增加，MDA含量明显下降（P<0.05）。　　 结论：（1）本实验动物模型采用较为常用的双侧颈总动脉永久性结扎，保证鼠脑不完全性缺血，与人类慢性脑低灌注相似。通过水迷宫试验证实了模型大鼠存在学习和记忆功能障碍，丁苯酞注射液可减轻大鼠的学校记忆障碍。（2）采用免疫组织化学方法，证实了在慢性脑低灌注状态下大鼠海马组织PARP表达增加，可能参与了慢性脑低灌注的代偿与适应机制。分别采用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸显色法测定2-VO大鼠前脑组织SOD活性及MDA含量，证实了2-VO后脑组织SOD活性下降，MDA含量增加。丁苯酞注射液治疗后大鼠海马组织PARP表达明显减少，前脑组织SOD活性明显增强，MDA含量明显下降，表明丁苯酞注射液可能通过抑制PARP蛋白表达，抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶活性，发挥清除自由基抗氧化作用，影响PARP介导的DNA损伤与修复机制，在大鼠慢性脑低灌注所引起的氧化应激中发挥神经保护作用。从而改善血管性认知障碍。

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