茄链格孢全基因组测序及SSR分子标记的开发

摘要

茄链格孢（Alternaria solani）引起的马铃薯早疫病是马铃薯上重要的病害之一。本研究对A. solani进行了全基因组测序及基因注释，为A. solani后续的功能基因组学研究提供了大量的基因资源，在此基础上对该菌全基因组基本特征、产孢基因、致病相关蛋白等进行了分析，主要研究结果如下：　　1.基因组测序与注释：通过构建插入长度分别为500 bp和5 kb的基因组文库，利用Illumina Hiseq 2000测序平台对A. solani HWC-168进行了全基因组鸟枪法测序。分别获得了21,909,421和33,720,474条读长，基因组覆盖度分别为200倍和308倍。采用 SOAPdenove 软件对序列进行拼接，最终得到 61 个 scaffold，基因组大小为32,838,780 bp，染色体的GC含量为51.20%。基因组序列已提交GenBank，接受号为JRWV00000000。　　2.比较基因组分析：通过比较被测的A. solani和已知基因组序列的A. arborescens和A. brassicicola发现，三者基因在几乎所有的COG功能类别中都有着相似的分布。相对较多的染色体蛋白参与细胞内进程与信号转导和基本代谢。同时我们发现A. solani在次生代谢产物的生物合成，转运及分解代谢中略占优势，在复制，重组和修复与信号转导机制占劣势，这些信息在以后的功能研究具有重要的指导意义。　　3.基因的预测：菌株A. solani HWC-168产孢基因分析发现15个与产孢相关的基因，分别为abaA、wetA、tpsA、rco-3、hsf2、mcb、StuA、FluG、FlbA、WC-1 (LreA)、CRY2、NOP-1、SPO71、SPO5、NiiA。无性发育调控中心的主要成员（abaA和wetA），中心调控修饰因子（StuA）和中心调控路径激活因子（FluG和FlbA）以及其他和产孢相关基因将为丝状真菌无性发育机制提供参考。此外，结合生物信息学软件SignalP、TargetP、TMHMM、Big-pi进行预测，得到了643个分泌蛋白。在此基础上对致病性相关蛋白进行挖掘，包括261个CAZymes酶类、138个病原菌寄主互作蛋白、119个RxLx模体蛋白以及27个特有分泌蛋白，这几个方面一定程度上揭示了茄链格孢分泌蛋白组成的复杂性和多样性。　　4.微卫星标记的开发：利用微卫星分析软件SciRoKo 3.3发现了2738个完美微卫星位点，70个复合微卫星位点。选择12株茄链格孢菌株对35个适合微卫星标记开发的位点进行引物专一性和微卫星的多态性检测，共开发出具有多态性的茄链格孢微卫星标记25对。　　5.角变菌株的SSR分子检测：茄链格孢菌株HQQ-2继代培养的过程中出现角变现象，并利用15对SSR引物对角变子和原菌株进行检测，结果发现角变菌株在继代培养过程中出现分化现象，并且角变子和原菌株在分子水平上出现差异，则茄链格孢在继代培养的过程中遗传物质产生了变异，由此推测茄链格孢可能存在准性生殖过程。

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