缺血预适应对局灶性脑缺血再灌注大鼠细胞色素C、凋亡诱导因子表达的实验研究

摘要

目的:　　通过观察缺血预适应对局灶性脑缺血再灌注后大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、病理组织学损伤的影响及缺血灶周围皮质区及海马CA1区细胞色素C（CytC）、凋亡诱导因子（AIF）表达的变化，探讨缺血预适应的脑保护作用?　　方法:　　采用线栓法制备雄性SD大鼠局灶性脑缺血再灌注改良模型，将100只大鼠随机分为假手术组（SO组）、缺血组（MCAO组）、预适应组（BIP组），其中MCAO组与BIP组分别于缺血2h再灌注2h、6h、12h、24h、48h、72h时间点处死，每时间点5只。每组于再灌注6h、24h、72h时间点各多5只大鼠做 TTC染色，进行脑梗死体积的测定；SO组于24h时间点处死，取5只大鼠进行 TTC染色。处死大鼠前各组均行神经功能缺损评分，各组大鼠脑组织切片行HE染色，并观察组织病理学改变、原位末端标记（TUNEL染色法）观察缺血灶周围皮质区及海马 CA1区凋亡神经元数、免疫组化染色观察缺血灶周围皮质区及海马CA1区CytC、AIF阳性神经元的表达?　　结果:　　1.神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织病理形态学观察：SO组未见神经功能缺损症状、缺血灶及脑组织病理性改变。与 MCAO组对比，BIP组在再灌注各时间点神经功能缺损评分低、缺血灶体积百分比小、脑组织病理学改变轻。　　2.SO组皮质区、海马CA1区可见1~2个TUNEL染色阳性神经元表达。MCAO组和BIP组缺血灶周围皮质区及海马CA1区TUNEL染色阳性神经元数均于缺血再灌注2h开始增加，之后随再灌注时间的延长 TUNEL染色阳性神经元数逐渐增高，缺血灶周围皮质区及海马CA1区再灌注24h在各观察时间点中表达水平最高，随后随再灌注时间点变化，表达有下降趋势，组内相邻时间点比较，差异有统计学意义（P<0.05）；在相同时间点BIP组缺血灶周围皮质区及海马CA1区TUNEL染色阳性神经元数量较 MCAO组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与SO组比较，MCAO组和BIP组各时间点 TUNEL染色阳性神经元表达均增高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　3.SO组皮质区、海马CA1区均可见少量 CytC阳性神经元表达；MCAO组和BIP组缺血灶周围皮质区及海马CA1区CytC阳性神经元表达均于缺血再灌注2h开始增加，随再灌注时间的变化CytC阳性神经元表达呈增高趋势，再灌注24h在各时间点表达水平最高，组内相邻时间点比较，差异有统计学意义（P<0.05）；在相同时间点BIP组缺血灶周围皮质区及海马CA1区CytC阳性神经元表达数量较 MCAO组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与SO组比较，MCAO组和BIP组各时间点CytC阳性神经元表达均增高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　4.SO组皮质区、海马CA1区均有少量AIF阳性神经元表达；MCAO组和BIP组缺血灶周围皮质区及海马CA1区AIF阳性神经元表达趋势基本一致，均于缺血再灌注2h表达开始增加，之后随时间的延长表达逐渐增多，在皮质区再灌注48h在各时间点表达水平最高，海马CA1区于再灌注24h在各时间点表达水平最高，组内相邻时间点比较，差异有统计学意义（P<0.05）；在相同时间点BIP组缺血灶周围皮质区及海马CA1区AIF阳性神经元表达数量较MCAO组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与SO组比较，MCAO组和BIP组各时间点AIF阳性神经元表达均增高，差异有统计学意义（P<0.05）。　　结论:　　1.缺血预适应后局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分降低、脑梗死体积减小、脑组织病理组织学损伤减轻，有效地减轻了脑缺血再灌注损伤。　　2.缺血预适应后局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血灶周围皮质区及海马CA1区神经细胞凋亡减少，起到脑保护作用。　　3.缺血预适应后局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血灶周围皮质区及海马CA1区CytC、AIF的表达减少，可能通过抑制CytC、AIF的表达，抑制凋亡的发生?

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 动物

1.1.2 主要实验试剂及药品

1.1.3 主要仪器和器材

1.1.4 免疫组化试剂的配置

1.1.5 载玻片处理

1.1.6 动物分组

1.1.7 建立模型

1.1.8 脑缺血再灌注模型的制备

1.1.9 模型入选标准

1.1.10 TTC染色及脑梗死体积测定

1.1.11 病理组织学切片制备

1.1.12 苏木精-伊红（HE）染色的操作步骤

1.1.13 TUNEL法原位检测细胞凋亡

1.1.14 免疫组化SP法检测CytC、AIF表达

1.1.15 图像分析及统计

1.2 结果

1.2.1 各组大鼠神经功能缺损评分结果

1.2.2 脑梗死体积测定

1.2.3 脑组织形态学改变

1.2.4 TUNEL染色结果

1.2.5 免疫组化结果

1.3 讨论

1.3.1 缺血预适应的脑保护作用

1.3.2 缺血预适应对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡的影响

1.3.3 局灶性脑缺血再灌注大鼠CytC、AIF的表达及缺血预适应对其影响

1.4 结论

参考文献

第2章 综 述细胞色素C、凋亡诱导因子与细胞凋亡的关系

2.1CytC与细胞凋亡

2.1.1CytC的结构与分子生物学特征

2.1.2CytC在细胞凋亡中的作用

2.2AIF与细胞凋亡

2.2.1.AIF的结构与分子生物学特征

2.2.2AIF在细胞凋亡中的作用

2.3CytC与AIF的关系

参考文献

附录

致谢

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