精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽修饰多孔钽材料对软骨细胞粘附性影响的实验研究

摘要

目的:　　研究RGD、ColⅡ和RGD/ColⅡ混合修饰多孔钽支架对其形貌及软骨细胞早期黏附、增殖、基质分泌等生物学行为的影响。探讨骨细胞外基质成分修饰多孔钽做为软骨组织工程支架材料修复软骨缺损、促进软骨再生，恢复软骨生理结构与功能的可行性，为进一步体内实验及临床应用提供实验依据。　　方法:　　1.扫描电镜观察多孔钽材料及RGD、ColⅡ和含1mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型胶原混合液修饰多孔钽支架后的形貌特征；检测并观察各组多孔钽亲水性。　　2.以含0.2mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型胶原混合液、含1mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型胶原混合液、含5mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型胶原混合液、含10mg/mlRGD和1mg/mlⅡ型胶原混合液、单纯1mg/ml RGD(Ta-RGD组)及单纯1mg/mlⅡ型胶原(Ta-ColⅡ组)分别对多孔钽支架进行修饰，以未修饰纯钽支架作为阴性对照组，空白24孔板作为空白对照组，将第2代软骨细胞接种到上述支架上，体外培养2h、4h，沉淀法检测各组支架软骨细胞粘附率，对所得数据进行单因素方差分析，并扫描电镜观察比较4h时细胞在各组钽材料上的黏附情况。　　3.兔软骨细胞与各组多孔钽支架体外复合培养，经扫描电镜观察比较细胞在材料上的黏附、形态、生长及增殖情况；MTT法检测比较各组多孔钽支架对软骨细胞增殖的影响；羟脯氨酸法测定各组多孔钽上软骨细胞分泌 II型胶原量。　　结果:　　1.多孔钽支架表面成蜂窝状，空隙分布均匀。扫描电镜观察，材料表面为直径约400~600μm微孔结构，孔隙为三维立体的连通结构，类似于松质骨。多孔钽经RGD修饰后，其三维立体多孔结构无明显变化，表面有斑点样涂层。多孔钽经ColⅡ及RGD/ColⅡ混合物修饰后，其三维立体多孔结构亦无改变，其表面可见一薄膜涂层，分布广泛，薄厚较均匀。　　2.亲水性测定：测得纯Ta组、Ta-RGD组、Ta-ColⅡ组及Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml组支架亲水率分别为1.3％±0.1%、1.5%±0.3%、4.1%±0.6%、4.3%±0.5%，修饰后多孔钽亲水率较纯钽显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　3.粘附率的检测：改性后材料细胞黏附率较改性前支架均有明显提高，各Ta-RGD/ColⅡ组＞Ta-ColⅡ组＞Ta-RGD组＞纯Ta组，组间比较均有统计学意义（P＜0.05）。另外不同浓度 RGD与 ColⅡ混合修饰多孔钽，其粘附率随 RGD浓度的增加而增加，RGD浓度提高到一定程度后，其促黏附能力存在饱和现象。扫面电镜观察结果印证了上述结论。　　4.细胞增殖检测：MTT法进行细胞增殖检测结果显示，第1天各组间比较，Ta-RGD组＞纯Ta组、Ta-ColⅡ组＞纯Ta组、Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml组＞RGD组、Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml组＞ColⅡ组，差异有统计学意义（P＜0.05），Ta-ColⅡ组虽高于 Ta-RGD组，但无统计学差异（P＜0.05）；第3天、5天、7天、10天和13天，Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml组＞Ta-ColⅡ组＞Ta-RGD组＞纯Ta组，各组间比较均有统计学差异（P＜0.05）。扫描电镜观察直观的印证了上述结论。5羟脯氨酸法测定各组多孔钽上软骨细胞分泌 II型胶原量，Ta-RGD/ColⅡ1.0mg/ml组＞Ta-ColⅡ组＞Ta-RGD组＞纯Ta组，组间比较均有统计学意义（P＜0.05）。　　结论:　　1.多孔钽经 RGD、ColⅡ修饰后其多孔结构无改变，但亲水性提高。　　2.经RGD肽修饰的多孔钽表面与软骨细胞具有较高的黏附率及活性，故可作为黏附识别序列促进软骨细胞在钽表面粘附和增殖；Ⅱ型胶原修饰多孔钽后同样与软骨细胞具有较好的粘附性和生物相容性。　　3.RGD-ColⅡ混合修饰多孔钽后，可在其表面模拟软骨细胞外基质，促进钽与软骨细胞的粘附及增殖，其中最优组为Ta-RGD/ColⅡ1mg/ml组，有望成为软骨组织工程的理想支架。

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料与方法

1.1.1 实验动物及材料

1.1.2 RGD、ColⅡ修饰多孔钽材料的形貌特征及亲水性

1.1.3 软骨细胞的分离培养及鉴定

1.1.4 RGD、ColⅡ修饰多孔钽对软骨细胞黏附的影响

1.1.5 RGD、ColⅡ修饰多孔钽对软骨细胞增殖的影响

1.1.6 羟脯氨酸法测定RGD、ColⅡ修饰多孔钽上软骨细胞分泌 II 型胶原量

1.2 结果

1.2.1 多孔钽支架修饰前后的形貌特征及亲水性

1.2.2 兔软骨细胞的形态学观察及鉴定

1.2.3 RGD、ColⅡ修饰多孔钽对软骨细胞粘附性的影响

1.2.4 RGD、ColⅡ修饰多孔钽对软骨细胞增殖的影响

1.2.5 扫描电镜观察Ta-RGD/ColⅡ-软骨细胞复合物的细胞形态

1.2.6 RGD、ColⅡ修饰多孔钽上软骨细胞分泌 II 型胶原量

1.3 讨论

1.3.1 多孔钽支架修饰前后的物理特性

1.3.2 种子细胞的选择及鉴定

1.3.3 RGD、ColⅡ修饰多孔钽支架对软骨细胞粘附、增殖及基质分泌的影响

1.4 结论

参考文献

第2章 综 述细胞外基质成分修饰骨科植入物的研究进展

2.1 Col I修饰物

2.1.1 Col I修饰钛及其合金

2.1.2 Col I修饰羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）

2.2 CS修饰物

2.2.1 CS修饰钛及其合金

2.2.2 CS修饰HA

2.3 RGD肽修饰物

2.3.1 RGD肽修饰钛及其合金

2.3.2 RGD修肽饰HA

2.4 其他细胞外基质成分修饰物

2.5 展望

参考文献

致谢

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