番泻中番泻苷提取分离工艺及其活性研究

摘要

番泻叶是一味常用的中药材，具有抑菌、泻下、止血等多种药理活性，应用前景良好，而番泻豆荚也含有与番泻叶相似的化学成分，因此，本研究旨在优化以番泻豆荚为原料的番泻苷A、B的提取纯化工艺并对其进行抑菌活性初探，为充分利用番泻药材资源，扩大番泻药材药用部位以及对番泻豆荚主要有效成分的开发利用提供一定参考。研究内容及结论如下：　　1.番泻苷A、B含量测定方法的确定、原料质量及稳定性的考察　　通过方法学考察，确定了简便、快速的番泻苷A、B高效液相色谱含量检测法，其条件为C18柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水（20∶80），检测波长为340nm，柱温为25℃。对番泻叶及番泻豆荚的质量研究发现，番泻豆荚中番泻苷A、B的含量均高于番泻叶，且不同部位含量分布由高至低依次为：豆荚壳＞叶片≈叶柄＞果柄＞种子。原料加速试验结果表明，番泻豆荚药材应密封保存于低温、干燥、避光处，建议保质期为一年以上。　　2.番泻豆荚中番泻苷A、B提取工艺的优化　　以番泻苷A、B总提取量为衡量指标，采用单因素实验结合正交试验法优选提取参数，并考察提取液最适存放pH。结果最佳提取工艺参数为0.5%碳酸氢钠溶液，料液比1∶15，温度70℃，提取2h，提取2次，在此条件提取率可达到94.84%；经典恒温试验考察提取液最适存放pH结果表明，番泻豆荚提取液常温下存放的最适pH为7.5，且建议存放不超过24h。　　3.大孔吸附树脂纯化番泻苷A、B工艺的优化及提取物稳定性的考察　　通过静态吸附试验对DM130、AB-8、LX-17、HPD417、ADS-F85种大孔树脂进行筛选并进行动态柱层析参数优化。结果AB-8型树脂吸附及解吸效果最好，最佳柱层析参数为：树脂饱和吸附量按生药计为0.21g·g-1，径高比1∶8，上样流速为1BV·h-1，洗脱流速为2BV·h-1，以3BV水除杂，3BV30%乙醇洗脱，洗脱液于70℃、0.08MPa真空度条件下减压浓缩至干，可得番泻苷A、B总含量为26.05%的提取物，得率为7.18%，上柱回收率为90.24%。番泻苷A、B提取物的高温试验及加速试验考察结果表明，番泻苷A、B提取物应密封保存于低温、干燥、避光处，建议保质期为一年以上。　　4.番泻苷A、B提取物中试生产工艺的调试　　称取3批次40kg干燥番泻豆荚，按优化确定的提取及柱分离工艺参数进行番泻苷A、B提取物生产中试调试。调试料液比为1∶10，上样流速为2BV·h-1，可得含量为26.15%的番泻苷A、B提取物，得率为7.28%，回收率为83.05%。　　5.高纯度番泻苷A、B的制备　　以含量为26.65%的番泻苷A、B提取物为原料进行硅胶柱层析分离，用乙酸乙酯-正丙醇-水（4∶4∶3）为洗脱剂，通过1次柱分离可得含量为97.39%的番泻苷A亮黄色针状结晶，2次柱分离可得含量为95.42%的番泻苷B黄色针状结晶。　　6.番泻豆荚抑菌活性的初探　　通过对大肠杆菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌4种细菌的抑菌效果测定，结果表明：番泻豆荚碱提液、水提液、醇提液和番泻豆荚碱提物、番泻苷A、B提取物、番泻豆荚水提物以及番泻苷A单体、番泻苷B单体对4种细菌均无抑菌效果；番泻豆荚醇提物仅对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌具有中等抑菌活性，且对2种细菌的最低抑制浓度均为25mg·mL-1，最低杀菌浓度均为25mg·mL-1，但对大肠杆菌和无乳链球菌也无抑菌作用。表明番泻豆荚中含有易溶于乙醇的抑菌成分，但番泻苷A和番泻苷B不是其抑菌有效成分。

目录

第一章 前言

1.1 番泻药材简介

1.2 番泻药材研究进展

1.2.1 化学成分

1.2.2 药理作用

1.2.3 番泻药材的开发利用

1.2.4 番泻药材中番泻苷A、B的含量同步检测方法

1.2.5 番泻药材中番泻苷A、B的提取方法

1.2.6 番泻药材中番泻苷A、B的纯化分离方法

1.2.7 番泻药材中番泻苷A、B的稳定性

1.3 研究目的及意义

1.4 研究内容

第二章 番泻苷A、B含量测定方法的确定、原料质量及稳定性考察

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 药材前处理

2.2.2 混合对照品储备液的制备

2.2.3 供试品溶液的制备

2.2.4 色谱条件

2.2.5 番泻苷A、B含量计算方法

2.3.1 高效液相色谱方法学考察

2.3.2 不同干燥方式对番泻叶及番泻豆荚中番泻苷A、B含量的影响

2.3.3 番泻叶和番泻豆荚及其不同部位番泻苷A、B含量的测定

2.3.4 原料药材番泻豆荚加速试验

2.4 小结

第三章 番泻豆荚中番泻苷A、B的提取工艺研究

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验仪器

3.2.1 色谱条件

3.2.2 番泻苷A、B含量计算方法

3.3 实验结果及分析

3.3.1 番泻苷A、B提取单因素实验

3.3.2 正交试验优选番泻豆荚中番泻苷A、B提取工艺

3.3.3 提取工艺验证实验

3.3.4 番泻苷A、B提取液保存最适pH的考察

3.4 小结

第四章 番泻豆荚中番泻苷A、B的纯化工艺研究

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验仪器

4.2.1 色谱条件

4.2.2 番泻苷A、B含量计算方法

4.2.3 上样液的制备

4.2.4 大孔树脂预处理

4.3 实验结果及分析

4.3.1 静态吸附-解吸实验筛选大孔吸附树脂型号

4.3.2 AB-8大孔吸附树脂富集纯化番泻苷工艺参数考察

4.3.3 大孔吸附树脂纯化工艺验证试验

4.3.4 番泻苷A、B提取物稳定性考察

4.4 小结

第五章 番泻苷A、B提取物中试生产调试研究

5.1 中试调试地点

5.2.1 中试材料

5.2.2 番泻苷A、B含量测定方法

5.3.1 中试设备配置

5.3.2 生产工艺流程及流程图

5.4 中试调试

5.5 三批次AB-8树脂纯化番泻苷A、B放大生产调试结果

5.6 小结

第六章 高纯度番泻苷A、B的制备

6.1.1 实验材料

6.1.2 实验仪器

6.2 实验方法

6.2.1 HPLC含量检测法

6.2.2 薄层色谱分析

6.2.3 硅胶柱层析分离番泻苷A和B

6.3.1 薄层色谱分析

6.3.2 硅胶柱层析分离番泻苷A和B

6.4 小结

第七章 番泻豆荚抑菌活性初探

7.1.1 实验材料

7.1.2 主要仪器

7.2.1 抑菌实验

7.2.2 培养基的配制

7.2.3 菌种活化

7.2.4 菌悬液的制备

7.2.5 实验材料灭菌

7.2.6 抑菌圈的测定

7.2.7 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

7.2.8 试药的制备、配制及灭菌

7.3.1 番泻豆荚不同提取液的抑菌效果

7.3.2 番泻豆荚不同浓度提取物的抑菌效果

7.3.3 番泻苷A、B单体的抑菌效果

7.3.4 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）

7.4 小结

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 展望

参考文献

致谢

科研成果

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