以LPS-TLR4信号为靶向评价金英黄归汤的抗炎机制

摘要

细胞膜表面的受体识别刺激源，将刺激信号传导进入细胞对于细胞的活化至关重要，目前乳腺上皮细胞（MECs)胞外LPS-TLR4炎症信号途径的研究报道甚少，LPS刺激MECs的条件如何，MECs是否存在CD14、MD-2,它们俩在MECs胞外LPS-TLR4炎症信号途径中作用如何，中药以胞外LPS-TLR4炎症信号为靶向的抗炎机制如何，这些都急需解决。为此，本课题体外培养小鼠MECs，采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS对小鼠MECs的IC50值和LPS刺激细胞的时间，通过荧光素标记的LPS刺激细胞，采用流式细胞术检测不同浓度LPS在不同刺激时间与细胞的结合率筛选刺激条件；设计CD14、MD-2引物，应用PCR技术检测小鼠MECs上CD14、MD-2 mRNA表达，采用流式细胞术检测细胞上CD14、MD-2蛋白表达；采用siRNA转染技术对培养细胞CD14、MD-2进行单独或同时转染，采用流式细胞术检测LPS与细胞结合率；采用ELISA方法检测C D14、MD-2单独或同时转染前后LPS介导细胞分泌炎症因子TNF-a、IL-6及IL-lβ的量；qPCR法检测金英黄归汤及有效成分对小鼠MECs上LPS-TLR4炎症信号途径相关因子CD14、MD-2 mRNA表达的影响。　　结果显示：　　（1)随着LPS(1μg/mL起）刺激浓度的增加，细胞OD490nm值逐渐低于空白组，50μg/mLLPS的OD490nm值极显著低于空白组(P<0.01)，LPS作用于细胞IC50为76.83μg/mL。与体外培养1h的细胞相比，培养6~48h的LPS(10μg/mL)组和相应空白对照组od490nm值都有极显著性上升(p＜0.1），且呈对数增长，LPS组与空白对照组之间没有差异（P>0.05)。当LPS的浓度≤5μg/mLH,细胞与LPS的结合率极快增长，当5~20μg/mL之后，细胞与LPS的结合率增长缓慢，呈现饱和状态。同样，当LPS刺激细胞≤6h时，细胞与LPS的结合率极快增长，当6~24h之后，细胞与LPS的结合率增长缓慢，也呈现稳定的平台期。　　（2)MECs上不仅有CD14、MD-2 mRNA的表达，且在细胞膜上有一定量的MD-2蛋白表达，而CD14蛋白微量表达。　　（3)选用获得CD14、MD-2 siRNA转染片段，将CD14、MD-2基因单独或同时沉默后，LPS与小鼠MECs的结合率都极显著抑制（P＜0.01），结合率分别下降了7.88%、3.00%、13.41%,同LPS组相比较都显著或极显著下调LPS介导下细胞分泌TNF-a, IL-6及IL-lβ的量(P<0.05，P<0.01)。　　（4)金英黄归汤低剂量组(40μ.mL-1)、金英黄归汤中剂量组（400μg?mL-1)、金英黄归汤高剂量组（4000^μg.mL-1)、绿原酸低剂量（20μg.mL-1)、绿原酸中剂量组（200μg?mL-1)、绿原酸高剂量（2000μg.mL-1)、连翘酯苷A低剂量（20μg.mL-l)、连翘酯苷A中剂量组（200μg-mL-1)、连翘酯苷A高剂量组（2000呢μg.mL-1)都能显著或极显著下调LPS介导下CD14和MD-2的mRNA表达CP<0.05, P<0.01)。　　结果提示：　　低浓度LPS对细胞生长有一定的促进作用，但随着LPS浓度的增加毒性作用越来越强。LPS刺激MECs的最适条件为浓度5~10μg/mL,刺激时间6~12h时，此时细胞与LPS的结合将达到饱和。MECs有CD14、MD-2的存在，它们是细胞胞外LPS-TLR4炎症信号途径重要基因。金英黄归汤及其主要成分都可以下调LPS介导的小鼠MECs的CD14、MD-2的mRNA的表达，这可能是金英黄归汤的抗炎机制。研究结果明确了MECs胞外LPS至TLR4信号途径，并从分子水平掲示中药对其的作用机制，解决中药作用机制不明确的问题，为中药治疗炎症提供理论数据。

目录

缩略语

前言

1 材料

1. 1 实验动物

1. 2 主要药物及试剂

1 .3 主要实验仪器

1 .4 主要溶液的配制

2 方法

2.1 LPS刺激细胞适宜条件的筛选

2 . 2 乳腺上皮细胞中CD14、M D-2表达的检测

2.3 CD14、MD-2在乳腺上皮细胞胞外LPS-TLIU炎症信号通路中作用的分析

2 . 4 金英黄归汤及其主要成分对乳腺上皮细胞胞外LPS-TLR4信号途径相关因子的影响

2 .5 统计学处理

3 结 果

3.1 LPS刺激细胞适宜条件的筛选

3 . 2 乳腺上皮细胞中CD14、M D-2表达的结果

3.3 CD14、MD-2在乳腺上皮细胞胞外LPS-TLIU炎症信号通路中的作用

3 . 4 金英黄归汤及其主要成分对乳腺上皮细胞CD14、MD-2的影响

4 讨论

4.1 LPS刺激细胞适宜条件的筛选

4 .2 乳腺上皮细胞胞外炎症信号通路的研宄

4 .3 金英黄归汤及其主要成分对乳腺上皮细胞胞外LPS-TLR4炎症信号途径相关因子的影响

5 结论

文献综述

参考文献

附录

致谢

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