人胃癌组织中肿瘤相关成纤维细胞与胃癌细胞的分离及其转录组学

摘要

目的：分离并鉴定胃癌相关成纤维细胞（gastric cancer-associated fibroblasts，CAFs）、癌旁正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs）及原代胃癌细胞（primary gastric carcinoma cells），比较CAFs与NFs的增殖差异以及对原代胃癌细胞克隆形成的影响，初步探讨CAFs与NFs转录组学的差异。　　方法:（1）选取临床胃癌患者手术切除的胃癌组织及癌旁正常组织（距癌周5cm以上、病理检测阴性），剪碎后胶原酶消化接种于预先包被的培养瓶中，常规传代培养。用免疫细胞化学染色检测细胞中平滑肌肌动蛋白α（α-smooth muscle actin,α-SMA）和纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）的表达鉴定CAFs与NFs，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞中α-SMA基因mRNA的表达水平；用HE染色、软琼脂克隆形成实验及免疫细胞化学检测细胞中癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和角蛋白18（cytokeratin18，CK-18）的表达鉴定原代胃癌细胞。CCK8实验检测CAFs与NFs的增殖并绘制生长曲线；将原代胃癌细胞分别与CAFs和NFs混合培养，平板克隆形成实验及结晶紫染色检测原代胃癌细胞的克隆形成能力；幽门螺旋杆菌以感染复数1:100分别感染CAFs及原代胃癌细胞，倒置显微镜下观察细菌对细胞的黏附情况。（2）挑选3对临床表型相似、病理诊断为胃腺癌的病人的CAFs与NFs，配对进行转录组学研究，以CAFs/NFs比值差异两倍以上的基因为有意义的差异表达基因，将3个生物学重要组的差异基因两两交集之后并集，利用omicsbean在线软件进行生物信息学分析。　　结果：（1）成功从胃癌组织中分离出8株CAFs，5株NFs，3株原代胃癌细胞，且均能良好传代培养。免疫细胞化学染色显示α-SMA、FAP的表达在CAFs中成强阳性，在NFs中弱阳性或阴性，且两者均不表达CK-18；RT-qPCR结果显示CAFs中α-SMA基因的mRNA表达量显著高于NFs，差异有统计学意义（P<0.05），提示CAFs与NFs分离成功。生长曲线结果显示培养3天后CAFs的生长速度显著高于NFs，培养六天时差异达到最大（P<0.05）。（2）HE染色结果显示3株原代胃癌细胞呈现多形性、核大、畸形、核质比增大、核仁数增多，免疫细胞化学染色显示原代胃癌细胞中CEA、CK-18的表达均为强阳性，软琼脂克隆形成实验结果显示3株原代胃癌细胞均能在体外三维生长形成克隆球，提示分离的原代胃癌细胞具有恶性特征，鉴定成功。当CAFs与原代胃癌细胞共培养后，原代胃癌细胞的克隆数（70.4±8.6），显著高于NFs组（35.2±5.7）与空白对照组（33.1±6.6）（P<0.05），而NFs组与空白对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。此外，幽门螺旋杆菌不仅能够黏附胃癌细胞，也能黏附CAFs。（3）转录组学结果显示，在3个生物学重复组的CAFs中共获得147个差异基因，其中76个基因上调，71个基因下调。通过聚类分析、GO富集与KEGG富集，共富集到1727个生物学过程、84个细胞组分、153个分子功能和10个通路具有统计学意义。　　结论：1.成功从临床胃癌组织中分离到原代的CAFs、NFs和胃癌细胞。2.证实CAFs在体外的生长速度快于NFs，促进胃癌细胞克隆性生长的能力更强。3.在CAFs中获得147个差异表达的基因，参与肿瘤相关的重要生物学过程和信号通路，可能在胃癌的发生发展中起重要作用。

目录

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英文缩略词表

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 CAFs、NFs与胃癌细胞的原代培养与纯化

2.2原代CAFs与NFs的鉴定

2.3 原代胃癌细胞的鉴定

2.4 CAFs与NFs的生长情况

2.5 CAFs与NFs对原代胃癌细胞克隆形成的促进作用

2.6 H.pylori感染对CAFs和原代胃癌细胞的黏附情况

2.7 转录组学研究

3 讨 论

4 结 论

附表：附表A：三组CAFs中差异表达基因两两交集后并集的集合

参考文献

综述：胃癌相关成纤维细胞与肿瘤相互作用的研究进展

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致谢

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