黔产莪术提取工艺的研究及莪术油对直肠癌SW1463细胞株分泌相关因子的影响

摘要

目的：优选黔产莪术所含挥发油和姜黄素的最佳提取工艺；探讨黔产莪术挥发油对直肠癌SW1463株分泌相关因子的影响。　　方法:　　1.水蒸气蒸馏法提取莪术所含挥发油，根据单因素实验结果，选择提取时间、溶剂倍数、浸泡时间、和药材粒度为四因素，采用L9（34）正交表设计提取工艺，以提取挥发油的体积为指标；根据药典的挥发油含量测定方法采用高效液相色谱法（HPLC）测定黔产莪术油中的吉马酮和呋喃二烯含量；　　2.乙醇法提取去油莪术中的姜黄素含量，根据单因素实验结果，选择乙醇浓度和用量、提取次数和时间四因素,采用L9（34）正交表设计提取工艺，提取姜黄素浸膏；根据药典的姜黄素含量测定法，采用HPLC测定浸膏中的姜黄素含量，选择最佳提取工艺。　　3.体外培养直肠癌SW1463细胞，采用MTT法筛选黔产莪术油对SW1463细胞的有效药物浓度，并计算半数抑制率IC50，根据IC50设定药物浓度80，120，160，200μg.mL-1的剂量组，采用倒置显微镜观察细胞形态变化，Giemsa染色法观察莪术油对SW1463细胞凋亡形态学的影响；　　4.采用 ELISA法检测培养细胞上清中IL-2,IL-10,TGF-β1免疫因子的表达；采用Western Blot法检测培养细胞的Fas,FasL,TLR2,TLR4,C-Raf,Caspase-3蛋白表达。　　结果：　　1.黔产莪术鲜品100g加适量蒸馏水提取挥发油的出油量为0.4～1.2mL，折成干品后的出油率为1.48％～4.44%(mL/g)。影响挥发油提取的最大因素是提取时间，最佳提取工艺是药材粉碎粒径0.2±0.1cm，加5倍量水浸泡6h，提取8h，挥发油收率为1.2mL；HPLC测定结果吉马酮9.58%，呋喃二烯12.18%。　　2.影响姜黄素提取的因素是乙醇浓度，最佳提取工艺是提取挥发油后的莪术药渣加5倍量95%的乙醇，提取2次，每次2h。　　3.MTT检测发现莪术油对SW1463细胞有一定的增殖抑制作用，并呈现时间-剂量依赖性，莪术油作用细胞24h的IC50为128.28±11.84（μg·mL-1）；药物作用24h的细胞形态发生改变，随着药物浓度的增大，细胞数量逐渐变少；Giemsal染色细胞可见典型的凋亡形态学特征。　　4. IL-2、IL-10和TGF-β1的含量随药物浓度上升而表达减少，单因素方差分析，IL-2表达的组间差异有显著性（F=21.02，*P﹤0.05），IL-10表达的组间差异有显著性(F=23.11，P<0.01)；TGF-β1表达的组间差异有显著性（F=850.97,**P<0.01）；　　5. Western Blot法检测培养细胞中的蛋白表达。莪术油处理SW1463细胞24h后，与对照组比较，FasL蛋白表达上调（*P<0.05,**P<0.01），Fas蛋白表达下调(*P<0.05)，TLR2蛋白(**P<0.01)和TLR4蛋白(*P<0.05)表达下调，TGF-β1和C-Raf蛋白表达下调(*P<0.05,**P<0.01）,Caspase-3蛋白表达上调(*P<0.05)。　　结论：　　1.建立了合理可行的黔产莪术油和姜黄素的提取工艺，莪术油含量测定结果表明黔产莪术可作为药材使用。　　2.黔产莪术油能抑制直肠癌SW1463细胞的细胞增殖；黔产莪术油抑制SW1463细胞的作用机制可能与下调Fas/FasL通路有关，使得TOLL样受体TLR2、TLR4蛋白表达下调，使得IL-2、IL-10、TGF-β1的表达下调，导致细胞凋亡。

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0 引 言

1材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 数据统计

2 结 果

2.1 莪术油提取工艺

2.2 姜黄素提取工艺结果

2.3 MTT比色法测定吐温-80对SW1463细胞增殖的抑制作用

2.4 MTT比色法测定黔产莪术油对SW1463细胞增殖的抑制作用

2.5 黔产莪术油对SW1463细胞作用24 h后的细胞形态改变

2.6 黔产莪术油对SW1463细胞作用24 h后的细胞形态改变

2.7 ELISA法测定SW1463细胞中IL-2、IL-10及TGF-β1因子的表达

2.8 Western blot法测定SW1463细胞中的蛋白表达

3 讨 论

3.1 提取工艺研究

3.2 MTT法检测莪术油对SW1463细胞增殖的关系

3.3 IL-2、IL-10、TGF-β1与细胞免疫

3.4 Fas 与 FasL、TLR2 与 TLR4 在免疫逃逸中的作用及 Caspase-3 与 C-raf的关系

3.5 莪术油与免疫

4 结 论

参考文献

综述:结直肠癌相关影响因子及免疫分子研究分析

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致谢

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