β-NGF基因克隆和诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用

摘要

目的：构建含有神经生长因子（β-NGF）慢病毒表达载体pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF，使用Tet-on3G四环素诱导表达系统，研究不同剂量强力霉素（Dox）诱导β-NGF基因表达对体外培养角膜缘干细胞（LSCs）增殖的影响。　　方法：　　1、从SD大鼠脑组织提取总RNA，逆转录成cDNA，利用分子生物学技术，克隆鼠的β-NGF基因完整编码区，将β-NGF基因定向插入载体pLVX-TRE3G-IRES中。　　2、将重组载体pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体pLVX-Tet3G分别转染HEK293FT细胞，制备收获慢病毒；共感染空白HEK293FT细胞，同时用不同剂量强力霉素（Dox）诱导NGF表达（分为未转染组、0、100、500和1000ng/ml Dox诱导表达组）。48h后，收集细胞，western-blot检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清，①Elisa检测各组上清内β-NGF的分泌量；②制作条件培养基，加入PC-12细胞培养基中进行诱导培养，观察PC-12细胞诱导分化情况。　　3、体外培养LSCs，慢病毒共感染LSCs，分为对照组(未转染组)和诱导表达组〔实验组A（pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF和pLVX-Tet3G共感染，Dox1000ng/ml）、实验组B（pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF和pLVX-Tet3G共感染，Dox100ng/ml）、实验组C（pLVX-TRE3G-IRES和pLVX-Tet3G共感染，Dox1000ng/ml）〕进行培养，分别选取各组诱导表达48h后的细胞，细胞免疫荧光染色检测NGF、p63、TrkA、p38表达。　　4、相关数据作统计学分析。　　结果：　　1.双酶切和测序鉴定重组质粒pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确。　　2、β-NGF在转染细胞内被诱导表达，随着Dox剂量增加，表达量增强；β-NGF在细胞培养基的上清内表达，表达量随Dox剂量增加而增多。　　3、诱导表达的条件培养基可诱导PC-12细胞形态改变，表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）蛋白。　　4、NGF在LSCs内被诱导表达，随着Dox剂量增加，NGF表达量增强；各实验组p63、TrkA随着NGF的表达量增加而降低，p38表达量的随着NGF的表达量增加而增加。　　结论：　　1、成功重组慢病毒载体pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌，且该蛋白具有诱导PC-12细胞向神经元样细胞分化的能力。　　2、运用Tet-On3G四环素诱导表达系统，可成功在LSCs获得不同剂量NGF蛋白表达，低剂量诱导组诱导表达NGF能够保持LSCs干细胞特性且对其具有促进增殖的作用。

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英文缩略词表

0 引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 重组载体结果

2.2 将重组载体感染293FT细胞，进行重组载体有效性的鉴定结果

2.3 实验组HEK293FT细胞培养液对PC12细胞的影响

2.4体外培养LSCs形态学观察

2.5 免疫荧光染色示NGF的表达

2.6 免疫荧光染色示p63阳性细胞

2.7 免疫荧光染色示TrkA、p38阳性细胞

3 讨论

3.1 四环素诱导表达系统的选择

3.2 神经生长因子与角膜缘干细胞的关系

3.2 NGF受体TrkA在角膜缘干细胞的表达及作用机制

4 结论

参考文献

致谢

综述：神经生长因子的研究进展

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