利用CRISPR/cas9技术研究ATF4对膀胱癌细胞生物学行为的影响

摘要

目的:通过免疫组化，研究ATF4基因与膀胱癌分期的关联。进一步利用CRISPR/cas9技术构建ATF4基因敲除的膀胱癌细胞(T24)株，研究ATF4基因对膀胱癌细胞生物学行为的影响。　　方法:(1)利用免疫组化对61例分期不同的膀胱癌组织进行染色，研究分期不同的膀胱癌组织中ATF4的表达情况。(2)利用CRISPR/cas9技术，针对ATF4两个外显子区，设计两对gRNA，通过BbsI酶对PX459载体质粒进行酶切，将gRNA链接到PX459载体质粒上，将构建好的PX459-ATF4-gRNA载体质粒通过脂质体转染进T24细胞中，对ATF4两个外显子区进行敲除。并通过PCR，琼脂糖凝胶电泳，测序和Western-blot对敲除效果进行验证。(3)利用Transwell实验来检测T24细胞在ATF4基因被敲除后，迁移和侵袭能力是否发生变化。通过克隆形成实验来检测敲除前后T24细胞克隆形成的能力。　　结果:(1)在免疫组化实验中发现，膀胱癌组织分期越高，ATF4的表达就越高。(2)通过PCR琼脂糖凝胶电泳及测序显示gRNA成功插入到PX459载体质粒中，对转染PX459-ATF4-gRNA载体质粒的T24细胞，通过PCR琼脂糖凝胶电泳，发现目的条带变短并与预期结果相同，测序也显示序列变短，Western-blot清楚地显示ATF4基因完全敲除，这些结果说明成功构建了ATF4基因稳定敲除的T24细胞。(3)对ATF4基因敲除的细胞实验发现，ATF4基因表达沉默抑制了T24细胞克隆形成能力(P＜0.05)，并且T24细胞迁移和侵袭的能力降低(P＜0.05)。　　结论:(1)膀胱癌分期越高，ATF4基因的表达越高。(2)成功构建了稳定敲出ATF4基因的T24膀胱癌细胞。(3)敲除ATF4基因会使T24细胞的克隆形成，迁移和侵袭能力降低(P＜0.05)。

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个人简历

摘要

前言

第一章 ATF4在膀胱癌组织中的表达

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第二章 利用CRISPR／cas9技术构建ATF4敲除的细胞株

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三章 ATF4基因敲除对膀胱癌细胞T24在生物学行为的影响初步探讨

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

综述 ATF4与肿瘤细胞应激反应的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文