禽呼肠孤病毒在不同细胞系中增殖规律及其σB、σC基因在杆状病毒系统中表达的研究

摘要

禽呼肠孤病毒（ARV）是呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)分支的重要成员，感染宿主常为鸡、番鸭及一些鸟类，常见临床病症有吸收不良综合征、病毒性关节炎以及免疫抑制性疾病。ARV危害严重，给世界养禽业造成了难以估量的经济损失。研究发现，ARV可以在鸡肝癌(LMH)细胞系、绿猴肾(Vero)细胞系、鸡胚成纤维(DF-1)细胞系等多种细胞系中进行增殖，但有关于其增殖规律的研究尚未见报道。杆状病毒表达系统是基因工程的四大表达系统之一，其具有外源基因表达量高、可携带较大的基因片段、表达产物生物活性好等多种优势。ARV编码的σB、σC蛋白是其病毒粒子的外衣壳蛋白，σB蛋白携带有群特异型中和抗原决定簇，σB蛋白通过σC蛋白作用，提高ARV感染细胞的能力。σC蛋白携带有ARV特异性中和反应的表面抗原，能刺激机体产生保护性的中和抗体，并与病毒粒子的吸附、增殖等过程有关。因此，σB蛋白和σC蛋白是研制ARV疫苗的首选蛋白。为此，本课题首先研究了ARV在几种细胞系中的增殖特性，随后通过杆状病毒表达系统表达ARVσB、σC抗原蛋白，并分析其生物学活性。以期为ARV的防控提供理论依据和技术支撑。本研究结果主要分为四部分。　　1.ARV增殖特性的研究　　将ARV S1133毒株梯度稀释接种鸡肝癌(LMH)细胞系、非洲绿猴肾(Vero)细胞系和鸡胚成纤维(DF-1)细胞系，分别测定ARV感染三种细胞系后八个时间点(0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h)的病毒滴度，并绘制ARV在三种细胞系上的生长曲线，分析其增殖规律。结果显示，ARV在Vero细胞系上增殖更快，病毒滴度更高，稳定期更长，更适合ARV的增殖。同时产生稳定的CPE，且在感染后48h达到病毒滴度峰值，为1×10-8.46/0.1mL。　　2.构建ARVσB、σC基因的表达载体　　分析NCBI数据库中σ-B、σC基因与表达载体序列特征，设计特异性引物扩增σB、σC基因并构建其重组表达载体，命名为σB-pFast HTB、σC-pFastDual，对重组表达载体进行双酶切验证及测序验证。结果显示，成功扩增了σB、σC全长基因，并克隆至表达载体上，构建了σB、σC基因的重组表达载体。3.σB、σC蛋白在Sf9细胞中的可溶性表达　　将σB、σC重组质粒转化DH10感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组杆粒后分别转染Sf9细胞，获得了其重组杆状病毒，命名为BacSC-σB、BacSC-σC。并进行细胞形态学观察、DNA水平验证以及mRNA转录水平验证，同时测定其病毒滴度。研究结果表明BacSC-σB、BacSC-σC成功感染Sf9细胞，且转染后的Sf9细胞出现胞核变大，胞内出现颗粒样物质等典型CPE，重组杆状病毒转染Sf9细胞后的DNA提取物及RNA提取物均能检出目的片段大小的条带，BacSC-σB的TCID50为10-942/0.1mL、BacSC-σC的TCID50为10-8.31/0.1mL。4.σB、σC蛋白的初步验证　　提取重组蛋白，命名为rBacSC-σB、rBacSC-σC，对重组蛋白进行IFA、SDS-PAGE及Western Blot初步验证。结果表明:σB、σC蛋白成功在Sf9细胞中表达;IFA结果显示重组杆状病毒BacSC-σB、BacSC-σC感染的Sf9细胞均出现绿色荧光;SDS-PAGE、Western Blot结果显示rBacSC-σB在41kDa处有蛋白条带，rBacSC-σC在35kDa处有蛋白条带，表明σB、σC重组蛋白成功在Sf9细胞中表达，且能与ARV阳性血清抗体反应，表现出较好的反应原性。　　本研究获得了ARV在几种细胞系中的增殖规律资料，完成了在杆状病毒表达系统中σB、σC蛋白的表达与鉴定，为下一步ARV疫苗的研究提供实验依据与技术支撑。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 禽呼肠孤病毒及其防控研究的进展

1．1．1 禽呼肠孤病毒的特点

1．1．2 禽呼肠孤病毒的研究进展

1．1．3 禽呼肠孤病毒结构的特征

1．1．4 ARV主要蛋白及功能

1．1．5 ARV疫苗研究进展

1．2 杆状病毒载体-昆虫细胞表达系统的简述

1．2．1 表达载体——杆状病毒

1．2．2 表达受体——昆虫细胞系

1．2．3 BVES的应用概况

1．2．4 小结

1．3 本课题的研究意义

第二章 禽呼肠孤病毒在LMH、Vero、DF-1上的增殖规律

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要试验仪器

2．1．3 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 ARV感染LMH、Vero、DF-1细胞

2．2．3 RT-PCR检测

2．2．4 病毒一步生长曲线的绘制

2．3 结果

2．3．1 细胞形态学检测

2．3．2 RT-PCR检测

2．3．3 ARV在LMH、Vero、DF-1细胞系上的生长曲线

2．4 讨论

第三章 禽呼肠孤病毒σB-pFast HTB、σC-pFast Dual重组载体及rBacmid重组病毒载体的构建

3．1 材料

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要试验仪器’

3．1．3 主要试剂

3．1．4 常用试剂配制

3．2 试验方法

3．2．1 技术路线

3．2．2 引物设计

3．2．3 ARV cDNA的获取

3．2．4 σB、σC基因的PCR扩增

3．2．5 σB-pMD-18T、σC-pMD-18T质粒的获得

3．2．6 pFast HTB质粒和pFast Dual质粒的获取

3．2．7 重组质粒σB-pFast HTB、σC-pFast Dua的获取

3．2．8 重组杆状病毒rBacmid载体的构建

3．3 结果

3．3．2 σB、σC基因连接pMD-18T载体

3．3．3 重组载体σB-pFast HTB构建结果

3．3．3 重组载体σC-pFast Dual构建结果

3．3．4 重组质粒σB-pFast HTB、σC-pFast Dual的双酶切验证

3．4 分析与讨论

第四章 ARV重组杆状病毒BacSC-σB、BacSC-σC的获得

4．1 材料

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要试验仪器

4．1．3 主要试剂

4．2 试验方法

4．2．1 技术路线

4．2．2 Sf9细胞的培养

4．2．3 转染Sf9昆虫细胞

4．2．4 细胞毒株P1代的扩增

4．2．5 DNA水平检测重组病毒

4．2．6 mRNA水平检测重组病毒的转录

4．2．7 重组病毒滴度的测定

4．3 试验结果

4．3．1 重组杆状病毒细胞形态学检测

4．3．2 重组杆状病毒DNA检测

4．3．3 重组杆状病毒转录的mRNA检测

4．3．4 重组杆状病毒液的滴度

4．4 分析与讨论

第五章 重组蛋白的制备及功能验证

5．1 材料

5．1．1 试验材料

5．1．2 主要试验仪器

5．1．3 主要试剂

5．2．1 技术路线

5．2．2 ARV阳性血清的制备

5．2．3 ARV重组蛋白的制备

5．2．4 ARV重组蛋白的功能验证

5．3 结果

5．3．1 ARV血清的ELISA检测

5．3．2 SDS-PAGE检测

5．3．3 IFA检测

5．3．4 Western blot检测

5．4 分析与讨论

全文结论

参考文献

致谢

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