VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及免疫原性初步研究

摘要

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，疫苗免疫仍是预防控制该病的主要手段。病毒样粒子(Virus-likeparticles，VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。PPV病毒样粒子(PPV-VLPs)是不含PPV DNA的空衣壳结构，由PPV VP2（下文简称:VP2）结构蛋白体外自行组装形成，形态上与天然病毒粒子相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22蛋白是该病毒的结构蛋白，不仅具有细胞间自由转运的能力，而且还可以促进融合抗原交叉致敏，增强免疫原性。此外，HSV-1 VP22（下文简称:VP22）蛋白还可能提高DNA疫苗的免疫反应。　　本研究分为三个部分，详细研究内容如下:　　1、细胞穿膜肽VP22对生物膜穿透性的研究　　以载体pEGFP-N1为模板扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，通过SOE-PCR分别将VP22基因片段拼接到EGFP基因的3'/5'端，获得VP22-EGFP和EGFP-VP22融合基因;将融合基因及EGFP基因分别克隆到pET-28a(+)载体构建重组表达质粒pET28a-EGFP-VP22、pET28a-VP22-EGFP和pET28a-EGFP，并进行测序分析及酶切鉴定，将鉴定正确的各重组表达质粒及pET-28a空载体分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)进行表达，表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析结果可见相对分子量分别为约31 kDa、31 kDa及27 kDa的蛋白分子条带，大小与预期相符，表明EGFP-VP22、VP22-EGFP、EGFP蛋白表达成功。对表达的蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化，将纯化后的蛋白添加到Vero细胞中进行共培养，10h后荧光显微镜下观察到加入VP22-EGFP和EGFP-VP22蛋白的细胞有绿色荧光，而加入EGFP的细胞与空白对照组细胞中则没有观察到绿色荧光存在，提示细胞穿膜肽VP22可有效携带与其融合的EGFP蛋白穿过细胞膜进入细胞，VP22蛋白融合到EGFP蛋白N端或C端并不影响VP22的穿膜效果。　　2、VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及鉴定　　利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统进行PPV VLPs的制备。以PPVN株的基因组为模板扩增其VP2基因，通过SOE-PCR分别VP22基因拼接到VP2基因片段的3'/5'端，获得VP22-VP2和VP2-VP22融合基因;将两种融合基因及VP2基因分别克隆到pFastBacTM1载体，获得重组质粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22及pFB-VP2。重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞进行同源重组，获得重组杆粒Bacmid-VP22-VP2、Bacmid-VP2-VP22及Bacmid-VP2。重组杆粒经脂质体法转染sf9细胞，获得重组杆状病毒株rBac-VP22-VP2、rBac-VP2-VP22及rBac-VP2。随后将重组杆状病毒株感染到sf9细胞进行重组蛋白的表达，表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定分析，结果可见相对分子量分别为约67 kDa、67 kDa及64 kDa的蛋白分子条带，大小与预期相符，表明VP2-VP22、VP22-VP2及VP2蛋白表达成功。进一步用PPV单抗对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定，可观察到特异性荧光，再次证实重组蛋白的表达且具有生物活性。表达产物经透射电镜观察，VP2和VP22-VP2均可自我组装形成22-24nm、形态类似天然PPV的病毒样粒子;VP2-VP22没有观察到病毒样粒子，表明VP2的N端融合VP22不影响VP2形成病毒粒子的特性，而C端融合外源蛋白可能影响VP2形成病毒样粒子。　　3、VP22短肽融合猪细小病毒样粒子免疫原性的初步评价　　用饱和硫酸铵法初步纯化病毒样粒子VP22-VP2(VLPs-VP22-VP2)、病毒样粒子VP2(VLPs-VP2)及重组蛋白VP2-VP22，分别配以弗氏佐剂、ISA206佐剂及白油司本佐剂制成疫苗免疫小鼠，并以PPV油乳灭活苗和PBS为对照，比较分析三种重组蛋白的免疫原性及筛选较好的免疫佐剂。通过间接ELISA检测免疫小鼠血清中PPV特异性抗体，结果显示VLPs-VP22-VP2及VLPs-VP2能有效诱导小鼠产生特异性PPV抗体，其配以ISA206佐剂免疫产生的抗体水平与PPV灭活苗基本相当，而重组蛋白VP2-VP22产生的抗体水平要明显低于PPV灭活苗组;IL-2是T细胞增殖的主要生长因子，IFN-γ仅由活化T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)产生，检测这两个指标的不同程度能反映动物机体的细胞免疫水平，对采集的免疫小鼠血清IL-2和IFN-γ含量测定结果显示，与阴性对照组相比，VLPs-VP22-VP2、VLPs-VP2及重组蛋白VP2-VP22免疫组均能有效刺激IL-2和IFN-γ的产生，且融合VP22的VLPs-VP22-VP2刺激机体产生IFN-γ和IL-2的水平显著高于VLPs-VP2及PPV灭活苗(P＜0.05)，此外，以ISA206为佐剂，其免疫增强的效果要优于其他佐剂(P＜0.05)。上述结果表明，融合VP22蛋白可明显提高VP2蛋白的特异性T淋巴细胞的免疫应答水平，但却不能显著提高VP2蛋白的体液免疫效果;VP2N端融合VP22蛋白的免疫效果要优于其C端融合。VLPs-VP2、VLPs-VP22-VP2配以ISA206佐剂免疫小鼠后能更有效地诱导机体产生针对PPV的体液及细胞免疫。

目录

声明

摘要

常用缩写词

第一章 文献综述

1．1 猪细小病毒病毒样粒子的研究进展

1．1．1 VLPs及其免疫机制

1．1．2 PPV-VLPs的研究现况

1．1．3 展望

1．2 细胞穿膜肽的研究进展

1．2．1 细胞穿膜肽的发现及应用

1．2．2 细胞穿膜肽的分类

1．2．3 HSV-1 VP22细胞穿膜肽的研究进展

1．2．4 展望

1．3 本研究的目的与意义

第二章 细胞穿膜肽VP22对生物膜穿透性的研究

2．1 材料与试剂

2．1．1 主要材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 目的基因的扩增

2．2．3 重组表达质粒的构建及鉴定

2．2．4 蛋白EGFP-VP22、VP22-EGFP及EGFP的原核表达

2．2．5 蛋白EGFP-VP22、VP22-EGFP及EGFP的Western Blot检测

2．2．6 蛋白EGFP-VP22、VP22-EGFP及EGFP对Vero细胞的毒性分析

2．2．7 融合蛋白EGFP-VP22和VP22-EGFP体外穿膜实验

2．2．8 数据统计

2．3 结果

2．3．1 目的基因的扩增

2．3．2 重组表达质粒的构建及鉴定

2．3．3 重组蛋白的诱导表达及表达形式分析

2．3．4 重组蛋白的大量表达及纯化结果

2．3．5 重组蛋白的Western Blot检测

2．3．6 融合蛋白的的细胞毒性检测

2．3．7 融合蛋白的体外穿膜实验

2．4 讨论

第三章 VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及鉴定

3．1 材料与试剂

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 PPV基因组的提取

3．2．3 PPV VP2基因的扩增

3．2．4 PPV VP2基因克隆载体的构建

3．2．5 VP2-VP22基因的扩增

3．2．6 VP22-VP2基因的扩增

3．2．8 重组杆粒Bacmid-VP22-VP2、Bacmid-VP2-VP22及Bacmid-VP2的构建及鉴定

3．2．9 重组杆状病毒的制备

3．2．10 重组蛋白的表达及检测

3．3 结果

3．3．1 PPV VP2基因的扩增

3．3．2 重组转移质粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22及pFB-VP2的构建与鉴定

3．3．3 重组杆粒的构建与PCR的鉴定

3．3．4 重组杆状病毒的制备

3．3．5 重组杆状病毒的滴度测定

3．3．6 重组杆状病毒的PCR鉴定

3．3．7 重组蛋白SDS-PAGE分析

3．3．8 重组蛋白的Western Blot检测

3．3．9 重组蛋白的免疫荧光检测

3．3．10 电镜观察病毒粒子的包装情况

3．4 讨论

第四章 猪细小病毒样粒子及融合蛋白免疫原性的评价

4．1 材料

4．1．1 主要材料及试剂

4．1．2 实验动物

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 免疫原的纯化及鉴定

4．2．2 疫苗制备

4．2．3 小鼠免疫试验

4．2．4 抗体水平的检测

4．2．5 细胞因子水平的检测

4．2．6 数据统计

4．3 结果

4．3．1 免疫原的纯化

4．3．2 酶标二抗和血清最佳稀释倍数

4．3．3 免疫小鼠血清PPV抗体检测结果

4．3．4 小鼠血清细胞因子水平的检测结果

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

在读期间发表论文情况