用发根农杆菌介导转化的方法探究木豆耐铝基因的特性

摘要

在亚洲国家中酸性土壤中，豆类作物的栽培非常普遍，豆类作物是这些国家人口粮食的主要蛋白源，而在酸性土壤中，过量的质子和过量的铝造成的根际铝毒是豆类作物低产的主要原因，也是酸性土壤最常见的问题。为了探究豆类作物中的耐铝基因的功能，通过转基因技术，提高豆类作物的耐铝特性，本研究开发了一个高效的发根转化系统，这个方法可用于表征基因功能，调节脉冲作物的耐铝性。　　1.建立高效的土壤农杆菌介导烟草叶片产生根状毛系统。利用发根土壤农杆菌侵染烟草叶片，将土壤农杆菌中的重要遗传信息转导到烟草的根状毛中，其高效转导的成功率是整个研究的关键。通过插入携带待研究的目的基因克隆到T-DNA上，通过电穿孔技术将携带目的基因的T-DNA插入土壤农杆菌中，随后通过介导转化，土壤农杆菌中的Ri质粒会与携带目的基因的T-DNA共同进入烟草叶片产生的根状毛中。本研究的结果表明，利用土壤农杆菌携带三种不同的目的基因介导野生型烟草和NtSTOP1突变体烟草叶片得到根毛的概率在80％以上，目的基因插入根毛的概率在90％以上。　　2.得到高效的根毛转化系统后，为了进一步验证使用土壤农杆菌介导烟草根状毛与烟草植株的根系是否在生理功能上一致，通过使用两种不同形状的烟草作为介导转化的宿主进行实验，测定通过土壤农杆菌介导转化后的烟草的根毛的耐铝基因的遗传信息和有机酸分泌的情况，研究结果表明，通过土壤农杆菌介导野生型烟草和NtSTOP1突变体烟草叶片形成的根状毛的有机酸分泌水平和NtSTOP1，NtMATE, NtALS3的表达量信息与前人使用这两种性状的烟草植株实验得到的结果一致，即NtSTOP1突变体烟草根毛没有分泌有机酸的功能，在无论是否有铝胁迫的情况下，NtSTOP1和关联基因NtMATE和NtALS3的表达量水平都很低。　　3.高效稳定的烟草根状毛系统的应用。在木豆(Cajanus cajan(L.)中克隆得到MATE（多药有毒化合物排出）基因并用绿色荧光蛋白进行细胞融合，标记CcMATE1∷ sGFP,在载体pBEAB中表达后通过电穿孔技术将其插入土壤农杆菌中的迷你Ti质粒中，随后通过土壤农杆菌介导NtSTOP1突变体烟草叶片得到根状毛，通过进行观察绿色荧光蛋白的烟草根状毛来筛选转导成功的烟草根状毛来进行后续的研究。通过绿色荧光显微镜观察得到CcMATE1在根尖细胞膜的细胞质膜上表达。原本没有耐铝功能的NtSTOP1突变体烟草根状毛，通过农杆菌介导转化后携带CcMATE1基因的NtSTOP1突变体烟草根状毛根尖有机酸分泌量是对照实验有机酸分泌量的4倍。　　综上所述，通过土壤农杆菌介导产生根状毛的根尖生理特性与植株本身根尖的生理特性一致，通过这个方法可以高效的检测到转基因作物中的特定目的基因的细胞定位表达和生理指标。通过这个方法利用土壤农杆菌携带目的基因转导到根状毛中也可以快速的测定目的基因的功能和生理特性，相对于常规的转基因方法，利用土壤农杆菌转导模式作物产生根状毛系统来检测目的基因的功能省去了插入标记筛选基因这个步骤，更加快捷方便的测定了目的基因的功能。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 我国南方酸性土壤的分布和特点

1．2 植物在受到铝胁迫时的表现与植物耐铝机制的研究进展

1．2．1 植物受到铝胁迫时的表现

1．2．2 植物的耐铝机制

1．3 通过研究耐铝基因改良植物耐铝性状的研究进展

1．3．1 MATE基因的耐铝机制及其研究进展

1．3．2 STOP1基因耐铝的机制及其研究进展

1．4 木豆的耐铝基因研究的意义

1．5 土壤农杆菌菌介导烟草形成根毛系统的机制与应用

1．6 研究的目的与意义及研究内容

2．1．1 材料

2．1．2 试验仪器

2．1．3 主要溶液和培养基的配制

2．2 试验方法

2．2．1 烟草的无菌培养

2．2．2 重组质粒电穿孔法转入土壤农杆菌

2．2．3 重土壤农杆菌菌液PCR验证

2．2．4 土壤农杆菌的细胞培养

2．2．5 土壤农杆菌侵染烟草叶片

2．2．6 CcMATE1基因的生物信息学分析

2．2．7 目的基因的亚细胞定位

2．2．8 GUS染色

2．2．9 DNA的提取

2．2．10 gDNA的提取

2．2．11 RNA的提取

2．2．12 柠檬酸的定量测定(酶循环法)

3．结果与分析

3．1 土壤农杆菌侵染烟草叶片形成根毛系统

3．2 计算T-DNA与土壤农杆菌中的Ti质粒的整和率

3．3 分析铝胁迫下的野生型烟草根状毛和NtSTOP1突变体烟草根状毛的有机酸分泌情况和相关联基因的表达情况

3．4 CcMATE1：：sGFP的生物学信息分析

3．5 CcMATE1：：sGFP的亚细胞定位

3．6 铝胁迫条件下携带CcMATE1的根状毛的根的生长状况

3．7 NtSTOP1突变体烟草根毛携带CcMATE1后的有机酸分泌

4．1 结论

4．1．3 利用NtSTOP1突变体烟草建立高效的根状毛系统

4．1．4 CcMATE1在NtSTOP1突变体烟草根状毛系统中基因功能的探究

4．2 讨论

4．2．1 本研究创新点

4．2．2 土壤农杆菌介导烟草根状毛的技术优点

4．2．3 有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况