壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝组织及肝状细胞Akt、XIAP因子表达的影响

摘要

目的:本课题旨在从在体和离体两方面观察研究壮肝逐瘀煎对肝纤维化（Hepatic Fibrosis，HF）大鼠肝组织及肝星状细胞(Hepatic stellate Cell，HSC)Akt、XIAP因子表达的影响，进一步阐释壮肝逐瘀煎抗肝纤维化的作用机制，为中医药治疗肝纤维化提供实验依据。　　方法:(1)在体实验:选用102只体重约220～250g的健康清洁级SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠，雌雄各半，为实验对象。随机选取14只作为正常对照组（A组）。剩余大鼠采用CCL4复合因素大鼠肝纤维化模型造模方法，进行肝纤维化造模。在第4周末A组及造模组大鼠随机各处死4只，进行病理检测，显示有肝组织纤维化形成，证实造模成功。然后剩余造模大鼠则随机分为:病理模型组（B组）、壮肝逐瘀煎大、中、小剂量（C组、D组、E组）治疗组、大黄蟅虫丸及秋水仙碱（F组、G组）对照组，每组分为14只大鼠，共六个组。造模4周后，给予壮肝逐瘀煎大、中、小剂量、大黄蟅虫丸及秋水仙碱组灌胃给药和正常组和模型组生理盐水，灌胃液体用量标准为1ml/100g，1次/天，按体表面积折算药物浓度和等效剂量。7组大鼠用不同剂量药物治疗6周后，禁食12小时，每组取10只大鼠，经10％水合氯醛麻醉后，再通过股静脉采血后处死，立即剖取肝脏，取肝脏右叶大致相同部位组织两块，一块置入10％甲醛中，留作常规石蜡切片，另一块于液氮中保存以备提取RNA，对其进行分子生物学及组织学检测。(2)离体实验:选用300-350g体重的清洁级SD大鼠20只，随机分为生理盐水组、壮肝逐瘀煎大剂量组、壮肝逐瘀煎中剂量组、壮肝逐瘀煎小剂量组及秋水仙碱组。按不同药液灌喂1周后，取各组动物血清冷藏备用。取出冻存的HSC-T6细胞株，将HSC-T6细胞株放在37℃C、5％CO2混合气体的孵箱中，用含青霉素(100U/ml)、胎牛血清(10％)和链霉素(100U/ml)的1640培养基培养和传代。当细胞状态达到良好后，将所有细胞用无血清的1640培养基培养24小时。取出之前培养的细胞，弃掉里面的培养液，加入适量相应制备好的动物血清培养基（生理盐水血清组、秋水仙碱药物血清组及壮肝逐瘀煎大、中、小剂量药物血清组）。置入37℃C、5％CO2的培养箱中培养24小时。再取出每组1瓶动物血清干预培养的细胞，向上述培养瓶中加入0.4m10.25％胰酶进行消化，离心，低温保存，培养48小时，对比48小时和24小时细胞培养差别。　　本实验用肉眼观察大鼠的主要症状和体征;观察肝组织的大体形态结构变化;用逆转录一聚合酶链反应法(reverse tralscriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)检测肝组织和肝星状细胞Al、XIAP基因表达水平;用western blot法检测肝星状细胞Akt蛋白的表达水平;用流式细胞术检测HSC-T6细胞的凋亡率。　　结果:(1)实验动物一般体征观察:壮肝逐瘀煎组，尤其是大剂量组可明显改善肝纤维化模型组大鼠的精神状态、活动量、饮食和皮毛色泽，其体重也有所增长。(2)肝纤维化大鼠肝脏组织大体形态的观察:壮肝逐瘀煎各组治疗后肝脏组织形态较模型对照组改善较为明显，大、中剂量组尤为显著。(3) RT-PCR检测大鼠肝组织中Akt、XIAPmRNA表达情况:①壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝组织AktmRNA表达的影响:结果显示壮肝逐瘀煎治疗组、大黄蟅虫丸组及秋水仙碱组均能降低AktmRNA的表达（P＜0.05）;壮肝逐瘀煎大剂量组效果最好(P＜0.01)，壮肝逐瘀煎中剂量组次之;壮肝逐瘀煎小剂量组和秋水仙碱组效果相当。②壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝组织XIAPmRNA表达的影响:结果显示壮肝逐瘀煎大剂量组能明显降低XIAPmRNA的表达(P＜0.01);壮肝逐瘀煎中剂量组和大黄蟅虫丸组也能降低XIAPmRNA的表达(P＜0.05);壮肝逐瘀煎小剂量组和秋水仙碱组效果相当。(4) RT-PCR检测大鼠肝星状细胞Akt、XIAPmRNA表达的情况:随着实验时间的延长，壮肝逐瘀煎各治疗组及秋水仙碱组均能降低大鼠肝星状细胞Akt、XIAPmRNA的表达（P＜0.05），其中以壮肝逐瘀煎大剂量组最为显著（P＜0.01）;实验48h壮肝逐瘀煎大剂量组肝星状细胞Akt、XIAPmRNA的表达较实验24h壮肝逐瘀煎大剂量组明显降低（P＜0.01）。(5)用western blot法检测肝星状细胞Akt蛋白表达情况:结果显示，壮肝逐瘀煎各治疗组、秋水仙碱组均能下调大鼠肝星状细胞内Akt蛋白的比值水平（P＜0.05），其中以壮肝逐瘀煎大剂量组的下调最为显著（P＜0.01）。实验48h壮肝逐瘀煎大剂量组肝星状细胞Akt蛋白的表达较实验24h壮肝逐瘀煎大剂量组明显下调(P＜0.01)。(6)流式细胞术检测结果显示:壮肝逐瘀煎各治疗组、秋水仙碱组与正常组相比，肝星状细胞的凋亡率均明显提升(P＜0.01)，有统计学意义;壮肝逐瘀煎各治疗组效果优于秋水仙碱组(P＜0.05)，有统计学意义。　　结论:壮肝逐瘀煎能通过调控肝纤维化大鼠肝组织和肝星状细胞Akt、XIAP因子的表达，抑制肝星状细胞的活化和增值，诱导肝星状细胞的凋亡，达到抗肝纤维化的作用。

目录

声明

摘要

引言

第一章 实验研究

第一节 实验材料

1 实验动物

2 实验药物

3 实验细胞

4 主要试剂

5 主要实验仪器

第二节 实验方法

1 在体实验

2 离体实验

3 统计方法

第三节 实验结果

1 在体实验

2 离体实验

第二章 讨论

第三章 结论

参考文献

附录

缩略词表

综述 中医药治疗肝纤维化机制的研究进展概况

致谢

个人简介及攻读学位期间的科研成果