ISSR标记对广西产鸡血藤遗传多样性及其混伪品鉴别的研究

摘要

目的：本文开展对广西产鸡血藤及其混伪品的ISSR指纹图谱与遗传多样性研究，为鸡血藤的品质鉴定与评价提供分子水平的理论依据，以期为临床的安全有效使用提供保障，也为广西产鸡血藤的质量评价体系的完善提供帮助。　　方法：在广西区内共采集9份正品鸡血藤，其中5份栽培品，4份野生品。同时采集了5种鸡血藤常见混伪品，分别为豆科植物网络崖豆藤（Millettia reticulate Benth.）、香花崖豆藤（Millettia dielsiana Harms.）、白花油麻藤（Mucuna birdwoodiana Tutcher.）、大果油麻藤（Mucuna macrocarpa Wall.）、常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl．），并对正品与这5种混伪品从形状、颜色、大小（直径）、表面特征、树脂状分泌物以及偏心性环纹数这几个方面进行了分析比较。在DNA分子标记方面，利用9种DNA提取方法对鸡血藤DNA进行了提取，鸡血藤常见混伪品中白花油麻藤、常春油麻藤、大果油麻藤均为油麻藤属植物，常用的CTAB（C16H33(CH3)3NBr十六烷基三甲基溴化铵）提取法未能提取出油麻藤属植物的DNA，且有文献曾报道在提取鸡血藤的混淆品种白花油麻藤时，由于不同植物存在不同次级代谢，该法得到的DNA无法进行PCR（polymerase chain reaction聚合酶链式反应）扩增。因此，我们提取油麻藤属植物DNA时，在植物基因组DNA提取试剂盒法基础上进行进一步的优化，对提取出的DNA进行电泳检测得DNA指纹图谱，并对结果进行分析。随之，采用ISSR方法进行广西产鸡血藤与其混伪品的真伪鉴别。并采用RAPD（随机扩增多态DNA random amplified polymorph ism DNA）方法与ISSR方法对广西产不同居群的鸡血藤进行遗传多样性分析。　　结果：1、性状比较方面：正品与混伪品从性状特征来看，主要是树脂状分泌物色泽的差异以及偏心性环纹数的不同。正品鸡血藤的偏心性环纹较多，而混伪品仅有1-2个，其他方面无特别明显的区别。2、DNA提取方面：比较9种方法提取出的鸡血藤DNA的质量，最终选定植物基因组DNA提取试剂盒法为鸡血藤DNA的提取方法，该法简便快捷，易于操作，且结果稳定，提取出的DNA可为后续PCR反应提供稳定模板。对于油麻藤属植物，最终选定植物基因组DNA提取试剂盒改良纯化法来去除油麻藤属植物中干扰DNA质量的多酚类物质等次生代谢产物，提出的DNA质量好，纯度高，为油麻藤属植物DNA的最佳提取方法。3、ISSR法鉴别广西产鸡血藤与其混伪品方面：从13条ISSR引物中筛选出5条多态性好，重复性高，稳定性强能够明显区别正品与伪品的引物，扩增出的DNA指纹图谱具有明显差异。4、RAPD与ISSR分析广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性方面：筛选出的3条RAPD引物及4条ISSR引物扩增后，共得到198和315个位点，多态性位点37、80个，多态性位点比率18.7%、25.4%，有效等位基因数为1.4168、1.5840，基因多样性指数为0.2694、0.3513，Shannon多样性指数为0.4316、0.5299，ISSR标记均高于RAPD标记，显然，ISSR标记检测多样性的能力更高。ISSR和RAPD的平均遗传相似系数为0.75764、0.68380，ISSR标记小于RAPD标记，表明ISSR检测遗传多样性更灵敏。通过Ntsys软件构建的RAPD和ISSR的聚类图看出，二者的聚类结果相近。且SPSS17.0软件的双变量相关分析(Bivariate)法对两种标记的遗传相似系数矩阵进行相关分析得出，两者的相关系数r=0.847，为极显著水平，表明结果的相似性。　　结论：ISSR标记方法可用来作为鉴别鸡血藤与其混伪品的手段，为鸡血藤与其混伪品在分子水平上的鉴定提供依据。比RAPD标记反映出更多的遗传多样性信息，更适合于广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性研究。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

引 言

参考文献

正 文

第一章 广西产不同居群的鸡血藤及其混伪品的采集

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结与讨论

第二章 广西产鸡血藤及油麻藤属植物DNA提取方法的研究

1 仪器、试剂与材料

2 方法

3 DNA检测

4 结果

5 小结与讨论

参考文献

第三章 ISSR法对广西产鸡血藤及其混伪品鉴别的研究

1 仪器、试剂与材料

2 方法

3 结果

4 小结与讨论

参考文献

第四章 RAPD与ISSR对广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性研究

1 仪器、试剂与材料

2 方法

3 结果与分析

4 小结与讨论

参考文献

结论与展望

综 述

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录

声明

个 人 简 历