促性腺激素释放激素激动剂对卵巢颗粒黄体细胞GnRHR/LHR/StAR表达的影响

摘要

促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是下丘脑弓状核合成的十肽激素，序列为(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-G1y-NH2)，已被证明是下丘脑一垂体一性腺轴的重要信息分子。生理情况下，GnRH以脉冲形式分泌，通过垂体门脉与垂体促性腺细胞表面特异性高亲和力的GnRH-R结合，通过调控促性腺激---促卵泡生成激素(FSH)、黄体生成素(LH)的合成与分泌，维持正常的生殖系统功能。 天然GnRH序列中第5-6，6-7，9-10位氨基酸链稳定性差，易受肽链内切酶作用而裂解，体内血浆半衰期仅2-4分钟。促性腺激素释放激素类似物(GnRH-analogtle)分别在第6、10位以右旋氨基酸替代天然GnRH序列中甘氨酸，使其与GnRHR亲和力增强20-100倍，延长了半衰期，增强了稳定性。基于GnRH-analogue与GnRHR结合的方式和对垂体FSH、LH的作用分为GnRH激动剂(Gorredottopin-releasinghormorle agorlist，GnRH-a)与 GnRH 拮抗齐0(Gonadotropin-releasing hormoneantagonist，GnRH-A)，激动剂给药初期出现激发效应刺激促性腺激素的释放，持续给药导致GnRH受体脱敏与下调，抑制促性腺激素的释放，从而达到抑制垂体一卵巢轴功能，从而在临床上表现出药物性卵巢去势作用。 基于GnRH-α初期给药的激发现象和持续给药降调垂体-卵巢功能的作用，有利于增加卵泡的募集、抑制内源性黄体生成素(LH)峰避免卵泡过早黄素化和提高卵子质量等重要作用，从20世纪90年代开始，GnRH-a联合促性腺激素方案已经成为体外受精一胚胎移植(Ⅵ F-ET)中可控制性诱导排卵的常规方案。但随着资料与数据的增加，发现GnRHa，对垂体一卵巢轴的过度抑制还可导致卵巢反应性下降，使用Gn剂量增加、时间延长，影响卵子成熟和胚胎早期发育。此外，GnRH-a抑制颗粒细胞激素合成和溶黄体作用，均不利于胚胎的着床和妊娠的继续。由此提出探讨GnRH-a对卵巢功能影响的基础研究、以期寻找合理的GnRH-a剂量与方案。 GnRH与受体结合产生介导一系列生物学效应。GnRH-R最早在垂体发现，主要分布于垂体前叶促性腺激素细胞。是分子量为60KD的糖蛋白，基因定位于4号染色体，包括3个外显子和2个内含子，是G蛋白偶连受体家族的成员。目前研究提示其合成受GnRH自身、类固醇激素(雌激素和孕激素)、激活素和抑制素四大因素调节。此外，第二信使激活剂对GnRH-R基因表达也存在一定影响。 近年在下丘脑一垂体轴外组织，如子宫内膜、卵巢、睾丸、胎盘和子宫肌等，尤其是人卵巢上皮细胞、肿瘤细胞系和排卵前卵泡与成熟黄体颗粒细胞层的GnRH及其受体表达研究[12，13，14]，提示其在GnRH对生殖功能的调控作用机制不仅包括垂体一卵巢轴的内分泌途径，还可能存在以旁/自分泌方式的直接作用。体外实验研究结果显示GnRH-a抑制颗粒黄体细胞孕酮分泌功能，但对低剂量GnRH-a的作用与机制还缺乏研究。 胆固醇向孕烯醇酮转化是卵巢类固醇激素生物合成的必经途径。类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regtllatory p rotein，StAR)是调控其限速步骤之一：胆固醇从线粒体外膜转运至内膜的的关键蛋白，它的表达受激素诱导调节。LH是StAR合成的主要上游调控通路，此外还存在其他信号如FSH、IGFs和EGF等的调节作用。 因此，在可控制性超排卵治疗中，了解GnRH-a剂量与方案对卵巢黄体功能的抑制程度与作用机制，有助于临床医师选择合适的方案以提高妊娠率。本实验针对这一问题，选取GnRHR、LHR、 StAR为研究指标，拟通过：1)低剂量GnRH-a降调节对在体黄素化颗粒细胞；2)GnRH-a不同浓度干预体外颗粒黄体细胞培养的实验研究，探讨GnRH-a剂量对颗粒黄体细胞的调控。 第一部分低剂量GnRHa对在体黄素化颗粒细胞GnRHR/LHR/StAR表达的影响研究目的低剂量GnRHa对IVF-ET周期中黄素化颗粒细胞GnRHR/LHR/StAR表达的作用研究方法选择在本中心行IVF-ET的患者20例20周期。实验组为因单纯输卵管因素或男方因素进行IVF-ET治疗的患者15例15周期，依黄体期GnRH-a长方案降调节剂量分为0.1mg/d，单次注射1.3 mg，1.8 mg三组，每组5例；对照组为仅采用FSH诱导卵泡发育拟行夫精人工授精治疗后因卵泡发育较多转为IVF-ET治疗的患者5例5周期。收集取卵日黄素化颗粒细胞，采用RT-PC免疫组化、Western Blot方法检测GnRHR/LHR/StAR的mRNA和蛋白表达。 研究结果 1 GnRHR mRNA相对积分值在对照组组和实验组(GnRH-a降调节)三种剂量组(0.1mg/d，1.3 mg，1.8 mg)分别为0.654±0.142、0.625±0.108，0.631±0.144和0.596±0.126。(P>0.05)2．LHR mRNA相对积分值在无降调节组和GnRH-a三种剂量组(0.1 mg/d，1.3 mg，1.8 mg)LHR mRNA表达相对积分值分别为1.524±0.263、1.479±0.216，1.451±0.249和1.330±0.198。 (P>0．05)3．StAR蛋白在各组黄素化颗粒细胞上均有表达4．StAR mRNA相对积分值在无降调节组和GnRH-a三种剂量组(0.1 mg/d，1.3 mg，1.8 mg)分别为1.276±0.212、1.311±0.149，1.341±0.198和1.198±0.120。(P>0.05)，5．StAR蛋白相对积分值在无降调节组和GnRH-a三种剂量组(0.1 mg/d，1.3 mg，1.8 mg)分别为1.268±0.142、1.345±0.166，1.326±0.135和1.238±0.136。(P>0.05)第二部分 GnRHa对体外培养的颗粒黄体细胞GnRHR/StAR表达的作用研究目的GnRHa对体外培养颗粒黄体细胞GnRHR/StAR表达的作用研究方法收集IVF-ET周期中予长效GnRHa(达菲林)1.3mg肌注长方案降调患者的取卵日颗粒黄体细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为3×10<'5>/ml。每皿4ml接种于60mm培养皿，用含15﹪FBS、100 U/ml penicillin G、100 μg/ml streptomycin的M199培养基培养，每天换液一次。四天后培养液更换为含5﹪FBS的M199培养基，六小时后实验组培养皿中分别加入终浓度为10<'11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>M的GnRHa，对照组不加GnRHa。培养24 h后，提取颗粒细胞总RNA及蛋白。以RT-PCR及Western-blot方法检测GnRHR/StAR mRNA及蛋白表达。实验均重复3次。 研究结论 1．GnRHRmRNAA相对积分值在在不同浓度GnRH-a干预组(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分别为0.628±0.139、0.636±0.105，0.655±0.112、0.616±0.095和10.614±0.128。 (P>0.05)，2．GnRHR蛋白相对积分值在不同浓度GnRH-a干预组(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分别为0.196±0.042、0.205±0.038，0.216±0.036、0.202±0.039和0.186±0.040。 (P>0.05)，3．StAR mRNA相对积分值在在不同浓度GnRH-a干预组(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分别为0.638±0.116、0.665±0.102，0.681±0.109、0.729±0.096和0.691±0.131。 (P>0.05)4．StAR蛋白相对积分值在不同浓度GnRH-a干预组(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分别为0.696±0.102、0.713±0.076，0.770±0.098、0.773±0.116和0.784±0.124。(P>0.05)全文结论1．低剂量GnRH-α对在体与体外培养颗粒黄体细胞GnRHRmRNA及蛋白表达无明显降调作用。提示GnRHa对其受体的调节机制在垂体与卵巢水平可能存在差异。 2．在IVF-ET周期中，低剂量GnRH-α对卵巢反应正常的妇女颗粒黄体细胞LHR表达无明显降调作用。 3．低剂量GnRH-α对在体与体外培养颗粒黄体细胞StAR mRNA及蛋白表达无明显降调作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

前 言

第一部分低剂量GnRHa对在体黄素化颗粒细胞GnRHR/LHR/StAR表达的影响

材料和方法

1实验材料

2.实验方法

结 果

附 图

第二部分GnRHa对体外培养颗粒黄体细胞GnRHR/StAR表达的影响

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

结 果

附 图

讨论

全文结论

参考文献

致 谢

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