发根农杆菌诱导甘薯发根及其应用研究

摘要

甘薯[Ipomoea．batatas(L.)Lam]是重要的粮食、饲料和工业原料作物，它对人体的防癌、抗癌等保健作用，早被国内外研究证实，被认为是21世纪人类最理想的食物。甘薯茎线虫病已成为制约我国甘薯生产的三大严重病害之一，由马铃薯腐烂线虫(Ditylenchus destructor)引起，近年来业已上升为北方薯区最严重的病害。为了很好地控制线虫病的发生和危害，必须了解植物寄生线虫的生活习性、生理生化特性、遗传特性和防治机理。因而建立一个适合线虫的培养体系，培养得到大量的一致的线虫群体作为研究对象就显得十分重要。本文围绕发根农杆菌发根培养无菌植物线虫体系的建立，研究线虫与寄主之间的抗感关系，旨在建立一种从细胞水平上研究植物和线虫关系的新的技术途径。其主要结果如下： (1)对诱导甘薯徐薯18发根的条件进行优化，试验按L<,9>(3<'4>)正交设计。通过PCR检测徐薯18和其发根中的rol基因。得到最佳诱导条件：用发根农杆菌A4经20min侵染，通过MSJ活化的徐薯18的茎切段生成发根的发根诱导率最高，最佳的除菌羧苄青霉素浓度为1.0mg/1.PCR检测证明得到的发根是发根农杆菌诱导产生的。在此优化条件下诱导的发根诱导率高，得到发根的可靠性强，且生成的发根粗壮、生长迅速、分支众多。 (2)利用发根农杆菌A4转化甘薯品种徐薯18和胡萝卜品种天红2号的发根，建立甘薯茎线虫病病原线虫的单寄主培养体系。通过该体系对马铃薯腐烂线虫的行为进行观察以及繁殖情况进行调查。结果表明：马铃薯腐烂线虫在甘薯和胡萝卜发根上都能正常发育和繁殖，完成其生活周期：培养4周和8周后，在甘薯发根上线虫繁殖倍数分别为2.6和50.6倍：在胡萝卜发根上线虫繁殖倍数分别为1.7和 9.9倍;相同培养时间内，线虫在甘薯发根上的繁殖数极显著高于在胡萝卜发根上的繁殖数：利用发根系统繁殖马铃薯腐烂线虫，便于研究其行为，在显微镜下可以直接观察到线虫在发根上活动情况，这对研究发根和线虫相互关系十分有利。初步证实构建甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫是可行的，且优于胡萝卜发根繁殖马铃薯腐烂线虫体系。 (3)本实验所使用的发根经过6个月以上的连续培养，生长迅速，发根易于继代培养，未出现退化。利用该体系鉴定甘薯品种抗线虫特性表明：在甘薯品种徐薯18、栗子香和鲁78066诱导的发根体系上，接种马铃薯腐烂线虫， 6周后调查发根繁殖线虫情况及线虫侵染发根情况，然后评价它们的抗线虫特性。结果表明：培养6周后，线虫在徐薯18、栗子香和鲁78066发根上繁殖倍数分别为8.82、0.76和0.70；在徐薯18发根上观察到多处线虫侵入位点，在栗子香和鲁78066发根上只观察到一处线虫侵入位点；基于以上结果，鉴定徐薯18为易感线虫病品种，栗子香和鲁78066为抗线虫病品种。鉴定结果表明用不同品种的甘薯发根作鉴定其抗线虫特性具有体系简单、直观方便、重复性好以及不受自然环境影响等优点，进一步完善可以作为植物对线虫病抗性鉴定新的体系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章绪论

1发根农杆菌诱导植物发根的研究进展

1.1发根农杆菌诱导植物毛状根的生成

1.2发根农杆菌诱导植物毛状根的应用

1.3问题与展望

2甘薯茎线虫病的研究进展

2.1甘薯茎线虫病的病原及其致病机理

2.2茎线虫病抗性的鉴定

2.3甘薯对茎线虫病抗性遗传与性状相关

2.4甘薯茎线虫病的综合防治

2.5展望

3本研究的目的和意义

第二章甘薯发根培养体系的建立

1材料与方法

1.1发根农杆菌

1.2植物材料

1.3发根农杆菌的单克隆挑取

1.4发根农杆菌的活化

1.5甘薯发根的诱导

1.6发根的选取、除菌和培养

1.7发根的鉴定

1.8发根诱导率及其计算方法

2结果与分析

2.1发根农杆菌诱导甘薯发根的正交试验设计

2.2发根条件优化的验证

2.3转化发根的PCR检测

3讨论

第三章发根培养马铃薯腐烂线虫体系的建立

1材料与方法

1.1发根农杆菌

1.2植物材料

1.3胡萝卜的发根诱导和培养

1.4马铃薯腐烂线虫的取材和分离

1.5发根培养马铃薯腐烂线虫体系的构建

1.6显微观察

1.7线虫繁殖计数与统计分析

2结果与分析

2.1发根农杆菌转化甘薯和胡萝卜发根的生成和扩繁

2.2马铃薯腐烂线虫的分离

2.3马铃薯腐烂线虫侵染发根情况

2.4发根繁殖马铃薯腐烂线虫情况

3讨论

第四章发根体系鉴定甘薯品种抗线虫特性的初步研究

1材料与方法

1.1甘薯品种的收集

1.2甘薯品种的发根诱导

1.3 DNA的提取和PCR检测

1.4线虫的分离和接种

1.5线虫繁殖计数、分析与显微观察

1.6评价甘薯品种对线虫的抗性情况

2结果与分析

2.1甘薯品种的发根诱导

2.2转化发根的PCR检测

2.3甘薯不同品种发根繁殖马铃薯腐烂线虫情况

2.4马铃薯腐烂线虫侵染发根情况

2.5甘薯发根培养体系鉴定甘薯品种对线虫病的抗性情况

3讨论

第五章结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

作者简介