AM真菌孢子的萌发及其和发根农杆菌诱导的毛状根共生体系建立的研究

摘要

丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌在自然界中分布非常广泛，据统计数据显示:地球上80％的维管植物都可与其形成互惠共生的关系。它们是土壤微生物群落中重要的组成部分，并且在农业中扮演着重要的角色。由于AM真菌本身具有专性共生的特性，纯培养技术到现在还无进展，双重培养技术，是近几十年时间人们用来探索AM真菌理化性质、形态结构、生物及非生物胁迫应答、根际生物之间的相互作用和分类系统进化等方面的一种理想模式，这种模式甚至为后期方便与分子生物学技术相结合，为系统的研究AM真菌打下坚实的基础。在前人的研究基础上，本文探索了离体条件下AM真菌孢子最佳消毒方法和培养基质以及影响AM真菌孢子萌发、菌丝生长的相关因子。研究了无菌条件下利用发根农杆菌诱导胡萝卜产生毛状根与AM真菌建立双重培养体系。论文取得的主要结果如下:
　　以发根农杆菌A4感染受伤的胡萝卜外植体并得到转化根的最佳诱导条件为，共培养基:VC+AS（乙酰丁香酮）的水琼脂培养基，OD600值为0.5～0.6时的菌液浓度可保证较高的发根率，加菌量为20μL，共培养时间2～3天，选择培养基加羧卡青霉素的量为500mg/L，除菌时间4天。
　　AM真菌孢子萌发及菌丝生长的最佳培养基为水琼脂。在3种处理中，处理3的消毒效果最好，即用无菌过滤膜加注1％氯胺T+200mg/L链霉素+100mg/L庆大霉素+1％Tween20处理15min，无菌蒸馏水漂洗6～10，孢子的萌发率达到了80.67％。
　　通过在培养Glomus intraradices孢子的水琼脂培养基中加入不同浓度的葡萄糖和不同浓度的根浸出液处理进行试验。结果表明，当葡萄糖浓度为5g/L时菌丝长度超过了对照组并且达到最长，这说明微量的葡萄糖可以促进菌丝生长分支。当根浸出液浓度为50mL/L时，孢子的萌发率和菌丝长度效果最佳，浓度为100～200mL/L的根浸出液也能明显的促进菌丝生长。
　　在以上实验的基础上，我们又添加了四种不同的氮源(NaNO3，NH4Cl，NH4NO3，尿素)，来探索葡萄糖、根浸出液分别和四中不同氮源共同作用对AM真菌孢子萌发的影响，结果显示:在葡萄糖加入到不同氮源的培养基中，孢子萌发和菌丝的生长都不显著，培养20天后，萌发率最大的葡萄糖+尿素培养基中也只达到57.33％，菌丝中除了葡萄糖+NH4NO3其余并没有明显差异，在根浸出液加入到不同氮氮源培养基中，孢子萌发都有显著的增加，萌发率在根浸出液+尿素的培养基中高达80.33％，其余的也都在61％左右，根浸出液+NH4NO3培养基中菌丝长度达到15.15mm/孢子，根浸出液+NaNO3培养基中菌丝长度是最小的，也达到10.33mm/孢子。
　　在合成培养基中成功建立Glomus intraradices与转化根的双重培养体系，两室培养基中产生大量丛枝以及新生孢子。

目录

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1 丛枝菌根真菌

1．1 丛枝菌根真菌简介

1．2 丛枝菌根真菌的结构

1．3 丛枝菌根真菌的生活史

1．4 丛枝菌根真菌的实际作用

2 丛枝菌根真菌的分类

3 丛枝菌根真菌的培养

3．1 盆栽法

3．2 培养基培养法

3．3 气雾培养法

3．4 AM真菌与转型根双重培养法

3．5 玻璃珠分离培养法

4 发根农杆菌

4．1 发根农杆菌研究背景

4．2 发根农杆菌Ri质粒的特性

4．3 Ri质粒转导外源基因片段的方法

5 课题研究的目的和意义

第二章 最适发根农杆菌诱导胡萝卜毛状根的条件探索

1 引言

2 实验材料与方法

2．1 实验材料与药品

2．2 培养基种类

3 方法

3．1 发根农杆菌菌株的活化与培养

3．2 外植体转化及毛状根诱导

3．3 发根条件的优化设计

4 实验结果

4．1 毛状根的诱导

4．2 发根条件的优化处理

4．3 其它因素对胡萝卜毛状根诱导的影响

5 讨论与分析

第三章AM真菌最适孢子消毒方法及培养基的筛选

1 引言

2 实验材料

2．1 材料与试剂

2．2 消毒处理

2．3 培养基

3 实验方法

3．1 AM真菌孢子的筛选及提纯

3．2 AM真菌孢子的消毒操作

3．3 孢子接种和培养

4 实验结果

4．1 不同培养基质对萌发率的影响

4．2 不同消毒方法对孢子萌发的影响

5 讨论与分析

5．1 最优消毒方法的探索

5．2 最佳培养基质的选择

第四章 葡萄糖和根浸出液对AM真菌孢子萌发的影响

1 引言

2 实验材料

2．1 供试菌种

2．2 供试材料

3 实验方法

3．1 试验方案

3．2 培养基配置

3．3 AM真菌孢子的筛选及提纯

3．4 AM真菌孢子的消毒操作

3．5 孢子接种与培养方法

4 实验结果

4．1 不同浓度的葡萄糖对孢子萌发率和菌丝长度的影响

4．2 不同浓度的根浸出液对孢子萌发率和菌丝长度的影响

5 讨论与分析

5．1 适合AM真菌孢子萌发和菌丝生长的葡萄糖浓度

5．2 适合AM真菌孢子萌发和菌丝生长的根浸出液浓度

第五章 不同氮源分别和根浸出液、葡萄糖共同作用对AM真菌孢子萌发的影响

1 引言

2 实验材料与试剂

2．1 材料

2．2 试剂

2．3 培养基与消毒液配方

3 实验方法

3．1 筛选与提纯孢子

3．2 AM真菌孢子的消毒方法

3．3 孢子的接种和培养

3．4 结果统计

4 实验结果

4．1 不同氮源和葡萄糖对Gi萌发率的影响

4．2 不同氮源和葡萄糖对Gi菌丝生长的影响

4．3 不同氮源和根浸出液对Gi萌发率的影响

4．4 不同氮源和根浸出液对Gi菌丝生长的影响

5 讨论与分析

第六章 转化根与AM真菌孢子共生体系的建立

1 引言

2 实验材料和试剂

2．1 材料

2．2 所需试剂

2．3 培养基和消毒液配方

3 实验方法

3．1 宿主植物根的培养

3．2 接种孢子的消毒操作

3．3 双重培养的建立

3．4 侵染率测定方法

4 实验结果

4．1 孢子萌发情况

4．2 共生时菌丝室中孢子的生长情况

4．3 对侵染率的影响

5 讨论与分析

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

声明